[医药卫生]第六章_大肠杆菌表达体系.ppt

人的胰岛素的编码基因位于第11号染色体上，只有一个拷贝。胰岛素本身不是基因的直接产物，而是经过多次加工间接形成的 基因的直接产物为前胰岛素原－胰岛素原－胰岛素分子 黄嘌呤核苷（Ion）是大肠杆菌合成蛋白酶的主要底物，Ion-营养缺陷型宿主菌不能合成黄嘌呤核苷，从而不能合成蛋白酶，保护外源蛋白 T4噬菌体的Pin基因产物是大肠杆菌蛋白酶的抑制剂，可以将pin克隆到质粒中，转化大肠杆菌，保护外源蛋白。如干扰素的生产 胰岛素的结构及其生物合成 胰岛素是治疗糖尿病的特效药，在临床上具有十分重要的作用。天然的胰岛素通常是从猪或牛的胰脏组织中提取的，由于来源少，含量低，因此价格十分昂贵，限制了实际用途 包涵体蛋白的变性与复性操作 1、收获与洗涤：包括细菌的收获、洗涤、破碎和离心收集适当的组分。一般在5000-10000g离心分离包涵体 洗涤液可用1%以下的中性去垢剂如Tween、Triton、NP40等，并在其中加入EDTA和二硫苏糖醇（DTT）、巯基乙醇等还原剂，盐浓度保持在50mmol/L水平。也可以用低浓度盐酸胍或尿素与中性去垢剂、EDTA等还原剂共同组成洗涤剂。其目的是去除吸附在包含体表面的不溶性杂蛋白，加入的洗涤液可通过柱层析等方法去除 2、 融合蛋白中的大肠杆菌蛋白或多肽部分除了具备高效表达的基本条件外，还同时具会下列特性中的一种或多种 维持整个融合蛋白分子的理想空间构象，以增加其水溶性 促进融合蛋白定位于细胞周质或外膜，以实现其可分泌性 提供融合蛋白一个用于亲和层析分离的靶多肽序列以简化异源蛋白的纯化程序 有时为了使融合蛋白分子同时具备上述多重特性，也可选用两种受体菌功能多肽编码序列 将目的基因与绿色荧光蛋白基因（GFP）融合，通过绿色荧光蛋白的荧光效应以对目的蛋白进行细胞或亚细胞定位 P Target 启动子 目的蛋白基因 终止子 P Target EGFP 限制性内切酶位点 Linker (poly-G) Actin Debrin Apoptosis 12 (7): 1155-1171, 2007 endoG-YFP (apoptotic endonuclease) Mitochondria Colocalization 目的蛋白的回收 第六章 大肠杆菌中表达系统 基因工程的重要目标之一,是制备大量的纯化蛋白质产物。为此就需要有一种能够高水平表达异源真核蛋白质或重组蛋白质的表达系统 良好的表达系统应包括多方面的因素，如寄主细胞的生长特性、蛋白质产物转移后的修饰与生物活性，以及异源蛋白质的表达水平及分泌方式等 目前这种表达系统有细菌、酵母、昆虫、植物和哺乳动物细胞等 大肠杆菌表达系统具有明显的优越性 大肠杆菌高效表达真核基因,涉及到三方面 强化蛋白质的生物合成 主要为外源基因剂量（拷贝数）、基因转录水平、mRNA翻译速率的时序性控制，这种控制是在重组分子构建过程中通过相应表达调控元件的精确组装来实现 抑制蛋白产物降解 维持或恢复蛋白质特异空间构象 6 外源基因在大肠杆菌中的表达 优化表达调控元件，应考虑以下方面 1·转录启动子和终止子的特点 2·核糖体结合位点的强弱 3·基因拷贝数及其是存在于质粒中，还是整合到寄主基因组中 4·合成的外源蛋白在细胞中的定位 5·寄主的翻译效率 6·所表达的蛋白在寄主中的自身稳定性 最佳启动子应具备的条件 1、强启动子 能使克隆基因的表达蛋白占细胞蛋白总量的10％～30％以上 2、能呈现低限的基础转录水平 在表达毒性蛋白质或有损于寄主生长的蛋白质时，使用高度抑制型的启动子 3、诱导型启动子 能通过简单的方式，或廉价的诱导物得以诱导。如大批量制备蛋白质时，热和化学诱导 启动子 启动子 启动子的分离 1、将目标原核细胞的染色体DNA用某一种限制性内切酶切成小的DNA片段 2、将这些DNA片段分别插入到一个缺乏自身启动子的报告基因的上游 3、通过抗性筛选表达强度高的克隆 4、对报告基因前的插入DNA片段进行分析，即可得到活性启动子 采用galK为报告基因的pKO1载体系统优点 1、可以根据转化子细胞中半乳糖激酶的产量的多少，鉴定启动子的强弱 2、根据在麦氏培养基中的菌落颜色特征，分离功能启动子 (2)滤膜结合法分离 双链DNA不能与硝酸纤维素薄膜有效结合，而DNA-蛋白质复合物却能在一定条件下结合在膜上 将待检测DNA片段与RNA聚合酶保温，并转移至膜上，温和漂洗薄膜，除去末结合RNA聚合酶的双链DNA片段，再用高盐溶液将结合在薄膜上的DNA片段洗下