贴壁细胞系的传代细.PDF

贴壁细胞系的传代 改编自Freshney, R.I., 1994。动物细胞培养：基本技术手册。第3版，Wiley-Liss ，纽约，美国。 概述 讨论 从培养容器中去除培养基，PBS 2 血清中含有胰蛋白酶的抑制剂。 5.加入含有血清的培养基（3–10mL/75cm 漂洗一下，将胰蛋白酶加入细胞， 孵 瓶面积），上下吹打细胞，直到细胞分 因此在第2步处理的时候，去除痕量的 育，加入含有血清的培养基终止胰蛋 散成单细胞悬液。 血清非常重要。 白酶的反应，分散细胞，稀释后放回 培养箱。 6.用血球计数板或库尔特粒度仪计数 第5步中培养基中含有的血清会使 并将细胞稀释到合适的接种浓度。 残留的胰蛋白酶失活并保护细胞免受 1.吸去用过的培养基并丢弃之。 伤害。如果使用无血清培养基，则可 7.向含有培养基的新的细胞培养瓶中 能需要另外添加胰蛋白酶的抑制剂如 2.向培养瓶中加入PBS （10 mL/75 加入适当体积的细胞悬液。 大豆胰蛋白酶抑制剂。胰蛋白酶的孵 cm2 瓶面积）， 注意不要扰动单细胞 育时间和分散细胞成为单细胞悬液使 层。轻轻前后摇动培养瓶以漂洗单细 8.将培养瓶放入培养箱，拧松瓶盖1/4 用的力度根据不同的细胞株也有所不 胞层。然后去除PBS。 圈，以便气体交换。 同。有必要调整这些参数来适应您所 培养的细胞。 3.加入胰蛋白酶(3mL/75cm2瓶面 积)，然后摇动培养瓶以保证整个单细 胞层都被胰蛋白酶溶液覆盖。 4.孵育至细胞开始脱壁，通常3-5分 钟。需要注意不要使细胞暴露在胰蛋 白酶溶液的时间过长。还要注意不要 在细胞消化不充分的情况下强行使之 脱壁，这样容易使细胞聚集成团。 78 细胞活力分析 改编自Freshney, R.I.,1994。动物细胞培养：基本技术手册，第3版，Wiley-Liss ，纽约，美国。 细胞活力分析可以测定细胞悬液 1.制备用于分析的细胞悬液（大约106 绍 介 法 方 养 培 胞 细 中存活细胞的百分比。一般通过染料 个细胞/毫升）。 排除的染色方法实现，即具有完整细 胞膜的细胞能够将染料排除在外从而 2.制备用0.4%台盼蓝溶液(SV30084.01) 不被染色，而不具备完整细胞膜的细 1：1稀释的细胞悬液。 胞则能够吸收染料而被染色。 3.将稀释液加入血球计数板的计数池中 用于排除染色法的染料通常选择 （见血球计数板）。 台盼蓝，但是赤藓红和萘黑也常被使 用。吸收染料的染色方法也可以用于 4.静置1-2分钟（时间不要太长，否则 测定细胞活力。这种情况下，染料被 活细胞也会死亡并开始吸收染料）。 活细胞正常吸收，而死细胞则不会。 例如双乙酰荧光素就是这类染色方法 5.用血球计数板计算被染色的细胞数和 中所使用的染料。 总细胞数。 台 盼 蓝 染 色 的 方 法 应 用 较 为