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DNA测序 黄宝福 hoyear@ fb枫岭生物 雅睿生物 双脱氧法测序（Sanger法） 双脱氧法又称末端终止法，用于单链测序 1982年Sanger 利用此原理建立了双脱氧测序法 。原理和加减法相似，但不再是加一种dNTP或 减一种dNTP,而是加入某一种双脱氧核苷，来 终止聚合反应。用此法测得越南伯克霍尔德氏 菌Burkholderia vietnamiensis G4含5577bp. 双脱氧法测序原理 • DNA 3` 5`- 链中的核苷酸是以 ， 磷酸二酯键相连接，合成 DNA 所用的底物是2`- 脱氧核苷三磷酸（dNTP ），在 Sanger 双脱氧链终止法中被掺入了2` ，3`-双脱氧核苷三 磷酸(ddNTP),当ddNTP位于链延伸末端时, 由于它没有3`- OH ，不能再与其它的脱氧核苷酸形成3′,5′-磷酸二酯键， DNA合成便在此处终止，如果此处掺入的是一个ddATP， 则新生链的末端就是A ，依次类推可以通过掺入ddTTP 、 ddCTP ddGTP T C G 、 ，则新生链的末端为 、 或 。 双脱氧法测序原理 脱氧核甘酸与双脱氧核甘酸结构比较 双脱氧法测序原理 • 4 在测序反应中通常设置 个反应，各反应管中同时加入一 种DNA模板和引物、DNA聚合酶I （失去5′ 3 ′外切核酸 酶活性）、其中一管中分别加入1种 ddNTP （如ddTTP dTTP 4 dNTP dATP dCTP dGTP 、 ）以及 种 （ 、 、 、 dTTP ），引物末端用放射性核素标记， ddTTP 的比例很 小（1:10），因此掺入的位点是随机的，经过适当的条件 下温育，将会有不同长度的DNA片段合成。它们都具有相 同的5′末端，3′末端都因掺入了ddTTP而以T结尾。在其 它三管中同理加入相应的ddNTP。 Sanger双脱 氧测序方法 示意图 双 脱 氧 法 测 序 原 理 示 意 图 电泳检测 步骤１：毛细管灌胶 步骤２：样品盘移动 步骤３：电进样及电泳 步骤４：荧光激发及检测 454 (GS-FLX)流程 1、文库制备：基因组DNA/cDNA片段化处理至300- 800bp间，经末端修复与特异性接头连接等修饰后 变性处理回收单链的DNA 。 454 (GS-FLX)流程 • 2、Emulsion PCR：单链DNA文库被固定在DNA 捕获磁珠上，乳化，形成油包水的混合物，每个独 特的片断在自己的微反应器里进行独立的扩增，回 收纯化； 454 (GS-FLX)流程 • 3、测序反应：携带DNA片段的磁珠被放入PTP板 中供测序反应使用。 454 (GS-FLX)流程 • 4 GS FLX 10 、数据分析： 系统在 小时的运行当中可 获得100余万个读长，读取超过4-6亿个碱基信息 焦磷酸测序法 • 第一步——测序引物和PCR扩增的、单链的 DNA模板杂交，与酶—DNA聚合酶（DNA polymerase ATP ATP ）、 硫酸化酶（ sulfurylase ）、荧光素酶（luciferase）