[农学]中国药科大学生物化学课件—05、蛋白质的结构.ppt

五、蛋白质的结构 （二）、蛋白质的一级结构（初级结构、肽链结构、化学结构） 1. 定义：指蛋白质分子中氨基酸连接成肽链的方式和排列顺序。是蛋白质最基本的结构,它是由基因上遗传密码的排列顺序决定的。它是蛋白质生物功能的基础。 2.蛋白质一级结构的测定 蛋白质氨基酸顺序的测定是蛋白质化学研究的基础。自从1953年F.Sanger测定了胰岛素的一级结构以来，现在已经有上千种不同蛋白质的一级结构被测定。 （1）测定蛋白质一级结构的原则 基本要求： a、样品必需纯（97%以上）； b、知道蛋白质的分子量； c、知道蛋白质由几个亚基组成； （1）测定蛋白质一级结构的原则 遵循原则： （1）、提纯蛋白质样品。 （2）、测定NH2末端基的数目，由此确定蛋白质分子由几条链组成。 （3）、拆开二硫键，将蛋白质分子中的几条链拆开，并分离出每条肽链得到伸展的肽链。 （4）、肽链的一部分样品进行完全水解，测定其氨基酸组成，由此确定各种氨基酸成分的分子比 （5）、肽链的另一部分样品进行NH2和COOH末端基鉴定。 （6）、应用两种或两种以上不同的水解方法将所要测定的蛋白质肽链断裂，各得到一系列大小不同的肽段。 （7）、分离提纯所产生的每个肽段，并测定其氨基酸顺序。 （8）、从有重叠结构的各个肽的氨基酸顺序中推断出蛋白质中全部氨基酸排列顺序。 （2）常用测定方法简介 A.测定蛋白质分子中多肽链的数目。 通过测定末端氨基酸残基的摩尔数与蛋白质分子量之间的关系，即可确定多肽链的数目。 （2）常用测定方法简介 B.多肽链的拆分。 由多条多肽链组成的蛋白质分子，必须先进行拆分。 （2）常用测定方法简介 B.多肽链的拆分。 几条多肽链借助非共价键连接在一起，称为寡聚蛋白质，如，血红蛋白为四聚体，烯醇化酶为二聚体；可用8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍处理，即可分开多肽链(亚基). （2）常用测定方法简介 C.二硫键的断裂 几条多肽链通过二硫键交联在一起。可在8mol/L尿素或6mol/L盐酸胍存在下，用过量的?-巯基乙醇(还原法)处理，使二硫键还原为巯基，然后用烷基化试剂（ICH2COOH）保护生成的巯基，以防止它重新被氧化。 （2）常用测定方法简介 C.二硫键的断裂 应用过甲酸氧化法拆分二硫键。 （2）常用测定方法简介 D.分析多肽链的N-末端和C-末端。 多肽链端基氨基酸分为两类：N-端氨基酸(amino-terminal)和C-端氨基酸。 在肽链氨基酸顺序分析中，最重要的是N-端氨基酸分析法。 Sanger法。2,4-二硝基氟苯在碱性条件下，能够与肽链N-端的游离氨基作用，生成二硝基苯衍生物（DNP）。 在酸性条件下水解，得到黄色DNP-氨基酸。该产物能够用乙醚抽提分离。不同的DNP-氨基酸可以用色谱法进行鉴定。 Edman （苯异硫氰酸酯法）氨基酸顺序分析法实际上也是一种N-端分析法。此法的特点是能够不断重复循环，将肽链N-端氨基酸残基逐一进行解离。 在碱性条件下，丹磺酰氯（二甲氨基萘磺酰氯）可以与N-端氨基酸的游离氨基作用，得到丹磺酰-氨基酸。 此法的优点是丹磺酰-氨基酸有很强的荧光性质，检测灵敏度可以达到1?10-9mol。 此法是多肽链C-端氨基酸分析法。多肽与肼在无水条件下加热，C-端氨基酸即从肽链上解离出来，其余的氨基酸则变成肼化物。肼化物能够与苯甲醛缩合成不溶于水的物质而与C-端氨基酸分离。 氨肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的N-端逐个的向里水解。 根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，按反应时间和氨基酸残基释放量作动力学曲线，从而知道蛋白质的N-末端残基顺序。 最常用的氨肽酶是亮氨酸氨肽酶，水解以亮氨酸残基为N-末端的肽键速度最大。 羧肽酶是一种肽链外切酶，它能从多肽链的C-端逐个的水解AA。根据不同的反应时间测出酶水解所释放出的氨基酸种类和数量，从而知道蛋白质的C-末端残基顺序。 目前常用的羧肽酶有四种：A,B,C和Y；A和B来自胰脏；C来自柑桔叶；Y来自面包酵母。 羧肽酶A能水解除Pro,Arg和Lys以外的所有C-末端氨基酸残基；B只能水解Arg和Lys为C-末端残基的肽键。 （2）常用测定方法简介 E.多肽链断裂成多个肽段，可采用两种或多种不同的断裂方法将多肽样品断裂成两套或多套肽段或肽碎片，并将其分离开来。 酶解法: 胰蛋白酶，糜蛋白酶，胃蛋白酶，嗜热菌蛋白酶，羧肽酶和氨肽酶 Trypsinase ：R1=Lys和Arg侧链（专一性较强，水解速度快）。R2=Pro 水解受抑。 或胰凝乳蛋白酶（Chymotrypsin）：R1=Phe, Trp,Tyr时水解快; R1= Leu，Met和His水解稍慢。 R2=Pro 水解受抑。 Pepsin：R1＝P