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荧光分析仪 王熙熙 （二）、荧光的产生 荧光：受光激发的分子从第一激发单重态的最低振动能级回到基态所发出的辐射。寿命为10-8~ 10 -11s。由于是相同多重态之间的跃迁，几率较大，速度大，速率常数kf为106~109 s-1。 荧光是指是在紫外或可见光照射下，电子跃迁至单重激发态S1(有时是S2， S3，但很少) ，并以无辐射弛豫方式回到第一单重激发态的最低振动能级，再跃回基态S0或基态中的其他振动能级所发出的光。 如果荧光几率较高，则发射过程较快，需10-8秒 发射荧光的能量比分子吸收的能量小，波长更长。 （三）荧光光谱（激发光谱与发射光谱） 由于荧光属于被激发后的发射光谱，因此它具有两个特征光谱，即激发光谱(excitation spectrum)和发射光谱(emission Spectrum)或称荧光光谱(fluorescence spectrum) 。 （1）荧光激发光谱（吸收光谱）：固定测量波长(选最大发射波长)，化合物发射的荧光(磷光)强度与照射光波长的关系曲线。激发光谱曲线的最高处，处于激发态的分子最多，荧光强度最大。 （2）荧光发射光谱（荧光光谱）：固定激发光波长(选最大激发波长), 测定该波长处的荧光发射强度随发射波长变化得到的光谱,简称荧光光谱。 （四）、荧光光谱的特点 斯托克斯位移（Stokes shift）:与激发光谱相比，荧光波长出现在更长的波长处。振动、热辐射将会使分子失去能量，即激发与发射荧光间的能量损失是Stokes shift产生的主要原因。 (2) 荧光发射光谱与激发波长无关：无论用λ=250和350nm作激发光源，所得荧光光谱形状和峰的位置都是相同。 电子跃迁到不同激发态能级，吸收不同波长的能量，产生不同吸收带，但均回到第一激发单重态的最低振动能级再跃迁回到基态，产生波长一定的荧光。 (3) 吸收光谱与发射光谱镜像对称 通常荧光发射光谱与它的吸收光谱（与激发光谱形状一样）成镜像对称关系。 内滤效应和自吸现象 溶液中若存在能吸收激发或荧光物质所发射光能的物质，就会使荧光减弱，这种现象称为“内滤光作用”。如色胺酸中的重铬酸钾。 内滤光作用的另一种情况是荧光物质的荧光发射光谱的短波长的一端与该物质的吸收光谱的长波长一端有重叠。 在溶液浓度较大时，一部分荧光发射被自身吸收，产生“自吸收”现象而降低了溶液的荧光强度。 三、荧光分析的仪器 1575年，西班牙医生N.Monardes发现荧光现象。 1852年，Sir George Stokes对荧光产生的机理作了解释，并提出了“荧光”。 1867年，Goppelsroder首次应用铝-桑色素配合物的荧光进行了铝的测定。 1928年，Jette和West提出第一台光电荧光计。 1952年，商品荧光分光光度计出现。 2、新技术 （1）激光荧光分析：用波长更长，强度更大的激光作光源，提高荧光法的灵敏度和专一性。可协调激光器作光源，荧光单色器省略。 （2）同步荧光分析：激发光谱和荧光光谱中选择一适宜的波长差值。 （3）时间分辨荧光分析等。 同步扫描荧光 根据激发和发射单色器在扫描过程中彼此间所保持的关系，同步扫描可分为固定波长差(Δλ)和固定能量差及可变波长三种； 同步扫描技术可简化光谱，谱带变窄，减少光谱重叠，提高分辨率；如图。 合适的Δλ可减少光谱重叠；酪氨酸和色氨酸的荧光激发光谱相似，发射光谱严重重叠，但Δλ15nm的同步光谱只显示酪氨酸特征光谱；Δλ60nm时，只显示色氨酸的特征光谱，实现分别测定。 4、定量分析 （1）标准曲线法 5、 定性分析 由两个特征光谱（荧光光谱，激发光谱）定性，可靠性强。但一定有标准品作对照。 6、应用 （1）无机化合物分析： 无机离子可以与一些有机化合物形成有荧光的络合物。 有机化合物绝大多数是芳香族化合物， 通常含有两个或两个以上的官能团，能与金属离子形成五元环或六元环的螯合物。螯合物的生成，分子的刚性平面结构增大，使原来不发荧光或荧光较弱的化合物转变为强荧光化合物。 其它应用 DNA的荧光效率低，常用荧光分子作为探针标记DNA。溴化乙锭(EB) 是探测DNA结构的典型的荧光探针分子，在激发波长546nm，发射波长590nm具有荧光强度与DNA数量成正比的特点，可用于定量分析。 Fx F Cs Cx F Cs Fx Cx 荧光熄灭工作曲线法 直接荧光标准曲线法 （2）直接比较法 空