[医学]第14章基因重组和基因工程3.ppt

基因重组和基因工程 Genetic Recombination and Genetic Engineering DNA克隆、测序与重组技术的历史 1973年，Stanley Cohen等人首次获得体外重组DNA的分子克隆 DNA克隆、测序与重组技术的历史 1977年，Allan Maxam和Walter Gilbert的化学裂解DNA测序问世 不久，Sanger 等的双脱氧测序法 DNA克隆、测序与重组技术的历史 20世纪90年代启动人类基因组计划(human genome project，HGP) 重组DNA技术学(Recombinant DNA Technology) Holliday模型的4个关键步骤： 两个同源染色体DNA排列整齐； Potter H.和Dressler D.在噬菌体中的拍摄到“十”字型结构的DNA电镜照片，为Holliday模型提供了一个有力的证据。 相关概念 DNA克隆 工具酶 目的基因 基因载体 基本原理 重组DNA技术与医学的关系 Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering Genetic Engineering （二）工具酶 限制性核酸内切酶 DNA聚合酶Ⅰ 逆转录酶 T4DNA连接酶 碱性磷酸酶 末端转移酶 Taq DNA聚合酶 （三）目的基因(target gene) cDNA (complementary DNA) 指经反转录合成的、与RNA (通常指mRNA或病毒RNA)互补的单链DNA。以单链cDNA为模板、经聚合反应可合成双链cDNA。 （三）目的基因(target gene) 基因组DNA (genomic DNA) 指代表一个细胞或生物体整套遗传信息(染色体及线粒体)的所有DNA序列。 能自主复制； 具有两个以上的遗传标记物，便于重组体的筛选和鉴定； 有克隆位点（外源DNA插入点），常具有多个单一酶切位点，称为多克隆位点； 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 （一）目的基因的获取 化学合成法 要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列 。 基因组DNA文库(genomic DNA library) cDNA文库(cDNA library) 聚合酶链反应(polymerase chain reaction, PCR) (见第22章) 表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的建立 表达产物的分离纯化 （六）克隆基因的表达 标准： 选择标志 强启动子 翻译调控序列 多接头克隆位点 1. 原核表达体系 (E.coli表达体系最为常用) 一类用于克隆大片段DNA的载体，它是由λ噬菌体的cos（cohesive）末端及质粒（plasmid）重组而成的载体。cosmid载体带有质粒的复制起点、克隆位点、选择性标记以及λ噬菌体用于包装的cos末端等，因此该载体在体外重组后，可利用噬菌体体外包装的特性进行体外包装，利用噬菌体感染的方式将重组DNA导入受体细胞。但它不会产生子代噬菌体，而是以质粒DNA的形式存在于细胞内。 粘性质粒(cosmid) 粘性质粒(cosmid) 酵母人工染色体 (yeast artificial chromosome, YAC) 细菌人工染色体 (bacterial artificial chromosome, BAC) 动物病毒DNA改造的载体 （如腺病毒，腺病毒相关病毒，逆转录病毒） 其他 二、重组DNA技术基本原理 基本原理 目的基因的获取 DNA导入受体细胞 外源基因与载体的连接 克隆载体的选择和构建 重组体的筛选 以 质 粒 为 载 体 的 DNA 克 隆 过 程 化学合成法获取目的基因 由已知氨基酸序列推测可能的DNA序列。 DNA合成仪 组织或细胞染色体DNA 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 含重组分子的转化菌 限制性内切酶 受体菌 基因组DNA文库 存在于转化细胞内由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合 从基因组DNA文库获取目的基因 限制酶切位点 限