蛋白质纯化方法流程.pptx

蛋白质纯化;蛋白质纯化方法流程图;预处理;粗分离; 盐析的机制是高浓度的盐溶液中的异性离子中和了蛋白质颗粒的表面电荷，从而破坏了蛋白质颗粒表面的水化层，失去了蛋白质胶体溶液的稳定因素，降低了溶解度，使蛋白质从水溶液中沉淀出来。 常用的中式盐有硫酸铵，硫酸钠，氯化钠等。盐析时，若把溶液pH值调节至该蛋白质的等电点，则沉淀效果更好。根据各种蛋白质的颗粒大小，亲水性的程度不同，在盐析时需要盐的浓度也不一致。因此，调解中性盐的浓度，可使蛋白溶液中的几种蛋白质分段析出，这种方法称分段盐析法。临床检验中常用此法来分离和纯化蛋白质。;离子交换层析色谱;离子交换剂的选择;离子交换层析; 对于一个缓冲系统来说要考虑的是缓冲成分、离子强度及pH值。如果缓冲离子带的电荷与交换剂功能基团的电荷相反，它们将参与离子交换过程，使局部的pH发生变化。所以阴离子交换剂要用阳离子缓冲液（如Tris、吡啶、咪唑、铵、乙二胺、烷基胺、氨基乙醇等缓冲液）；阳离子交换剂则用阴离子缓冲液（如醋酸、柠檬酸、甘氨酸、磷酸以及巴比妥等缓冲液）。 缓冲液的离子强度影响结合能力，离子强度低时对交换剂功能基团的竞争结合能力弱，所以蛋白质与交换剂的结合较强，增加离子强度则增加竞争作用，降低了交换剂与蛋白质的结合能力，结果将蛋白质从交换剂上洗脱。;;凝胶过滤色谱;凝胶过滤色谱分子筛;常用凝胶过滤用凝胶及其基本参数;亲和层析;金属螯合亲和色谱;实验步骤： 1.装柱前处理 用去离子水清洗，以除去储存液中的乙醇。 2.装柱及预处理 装柱注意气泡与分层；用NiSO4处理2-3个柱体积，再用去离子水洗去过量的金属离子。 3. 平衡 用平衡缓冲液平衡3-4个柱床体积，流速2.0ml/min。 4. 上样 将样品溶于平衡缓冲液中，经离心澄清后即可上样。 ; 5. 洗脱 采用咪唑亲和梯度洗脱，分别含 20、 50、200mM 咪唑的缓冲液进行阶段洗脱。 6. 收集样品 收集各阶段洗脱峰，用 SDS检测蛋白的分子量大小和纯度。 7. 柱的再生 先用500mM EDTANa2 处理30min，再???去离子水清洗至中性； 8.柱的保存 柱子置于20%的乙醇中，4℃环境中保存 。 ;谢谢！