生物制药——工程菌的高效表达及稳定性.ppt

工程菌的稳定性 具有良好稳定性的工程菌： （1）工程菌对外源质粒有较好的兼容性； （2）重组质粒结构稳定，不易发生缺失、插入或重排，能够保证构建基因的稳定性； （3）重组质粒表达较大，有利于该质粒在宿主菌中稳定共存。 常用的酵母启动子 启动子类型 所用的基因 基因符号 组成型 磷酸甘油酸激酶 PGK 烯醇脢 ENOL 3-磷酸甘油酸脱氢酶 GAPDH 乙醇脱氢酶 ADH 1，2 磷酸三糖异构酶 TRI 信息素-因子 MF 细胞色素c CYC 1 诱导型 酸性磷脂酸酯酶 PHO 5 半乳糖激酶 GAL 1 UDP-D-半乳糖-4-差向酶 GAL 10 2010.9.27 生物制药学 Company Logo LOGO 工程菌的高效表达与稳定性 080921班 王改改 楼春燕 080922班 郑翡　韩湘茹 2010.9.27 生物制药学 目录 酵母菌体系中的基因表达 2. 1. 工程菌的不稳定性 3. 提高稳定性的方法 4. 大肠杆菌体系中的基因表达 2010.9.27 生物制药学 概述 目的基因获得以后，必须在合适的工程菌中表达，才能获得目的产物。 工程菌要高效表达，应满足以下的条件：具有高浓度，高产量，高产率；能利用易得廉价原料；不致病，不产生内毒素；发热量低；容易进行代谢调控；容易进行重组DNA技术；产物易纯化。 理论上各种微生物都可以用于基因的表达，但由于克隆载体，DNA导入方法以及遗传背景等方面的限制，目前使用最广泛的工程菌仍然是大肠杆菌和酵母菌。 2010.9.27 生物制药学 大肠杆菌 真核基因要在大肠杆菌中复制与表达，必须要有合适的表达载体把真核基因导入工程菌中，然后将外源基因表达成蛋白质，根据真核基因在原核基因中表达的特点，表达载体必须具有一些特点，如能够独立复制，具有很强的启动子和终止子等。 2010.9.27 生物制药学 大肠杆菌高效表达的相关因素 外源基因的剂量： 一般来说细菌内基因拷内数增加，基因的表达产物也增加。 载体在工程菌中的拷贝数直接关系到外源基因的拷贝数。 外源基因的表达效率： 转录水平的高低是决定该基因能否高效表达的基础，而转录水平受到启动子等调控元件的控制。　　 核糖体结合位点的有效性。 2010.9.27 生物制药学 大肠杆菌高效表达的相关因素 SD序列和起始密码的间距。 密码子组成。　　　　　　 表达产物的稳定性： 组建融合基因，产生融合蛋白。 利用大肠杆菌的信号肽把真核基因产物搬动到胞浆周质的空隙中，此时外源蛋白质不易被细菌酶类降解。 采用位点特异性突变的方法，改变真核蛋白质中二硫键的位置，从而增加蛋白质的稳定性。 采用蛋白酶缺陷的大肠杆菌，有可能减弱表达产物的降解。　 2010.9.27 生物制药学 大肠杆菌高效表达的相关因素 细胞的代谢负荷： 外源基因的表达产物属于异已物质，可能对工程菌具有毒性作用，所以应合理调节这种消长关系，使工程菌的代谢负荷不致过重，又能高效表达出外源基因的产物。 将工程菌的生长与重组质粒的复制分开。当工程菌迅速生长时，抑制重组质粒的复制；当细胞生长到一定程度后，再诱导细胞中重组质粒的复制，增加拷贝数。 2010.9.27 生物制药学 大肠杆菌高效表达的相关因素 工程菌的培养条件： 外源基因的高水平表达，不仅涉及工程菌、载体和克隆基因三者之间的关系，而且与其所处的环境条件息息相关，必须优化基因工程菌的培养条件，进一步提高表达效率。 生物制药学 酵母体系中的基因表达 酵母是研究基因表达调控最有效的单细胞真核微生物，其基因组小，仅为大肠杆菌的4倍，世代时间短，有单倍体、双倍体两种形式。 酵母繁殖迅速，可以廉价地大规模培养，而且没有毒性。基因工程操作与原核生物相似。 目前已有不少真核基因在酵母中获得成功克隆和表达，如干扰素、乙肝表面抗原基因等。 2010.9.27 生物制药学 2010.9.27 酵母体系中的基因表达 酵母和其它表达系统一样，表达系统也包括载体、启动子等控制序列和宿主细胞三个主要部分。 （一）表达载体 酵母载体是可以携带外源基因在酵母细胞内保持和复制，并随酵母分裂传递到子代细胞的DNA或RNA单位。 2010.9.27 生物制药学 酵母菌体系中的基因表达 1、载体的复制序列 根据载体中来自酵母的复制序列的构成和特性，可以归纳成YEp类、YRp类、YCp类、YIp类4大类 2、克隆载体 从大肠杆菌中制备制粒比酵母中容易很多，因此酵母制粒的加工和制备大部分是通过大肠杆菌进行的，只是在最后阶段才转入酵母中，这就是要求酵母载体也同时具有在大肠杆菌中复制和繁殖的能力 2010.9.27 酵母菌体系中的基因表达 3、表达载体 将酵母的启动子和终止子等有关的表达控制序列引入上述载体的适当位置后，就构成了酵母的表达载体 生物制药学 201