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MEF的获取 需预先准备：37度预温的Trypsin-EDTA。 / }4 `/ ?$ C# B* u: D? ?（1）激素处理小鼠，同期发情和超数排卵% p% L5 Y# w* D3 q3 M? ?（2）2：1合笼过夜(雌：雄)1 r7 d: Z$ I( B/ x? ?（3）取出有阴道栓（即乳白色或淡黄色冻胶状物，确定其已经怀孕）的开始记时间为0.5天??; `; S% K- `2 k5 M9 l? ?（4）取出妊娠12.5-14.5天的小鼠为实验材料) m+ x U I2 w1 h2 @9 g0 s? ?（5）颈椎脱臼法处死孕小鼠，放于盛有75%酒精的烧杯中消毒，拿到超净工作台上解剖，先剖开腹部皮肤，暴露子宫，然后换另外一套手术器械，用眼科镊提起近子宫颈端,分离子宫系膜,剪断子宫角，取出子宫，置于装有PBS的培养皿中。7 N??F$ T+ e f [ X? ?（6）取出胎鼠，在PBS中洗涤数次。去除头、尾、内脏和四肢，仅留躯干部(取胎鼠四肢做genotyping)。在PBS中充分漂洗，弃除红细胞。(用两个镊子配合即可除去羊水膜、胎盘、头尾、内脏、四肢)（若是想培养神经干细胞，则用剪刀剪取前脑进行培养即可）（可以一起处理多个胚胎）??X3 ~% P8 H??P; u2 G n? ?（7）在新的培养皿中加入少量PBS，放入躯干部分，用眼科剪刀剪成1mm3以下的组织块碎片（可以剪的更碎一点，下步的消化时间就可以缩短）。* （8）移入50ml管中，加入10ml37度预热的Trypsin，分别用10ml管，5ml管，巴斯德管各吹打100次。将悬液转入另一50ml离心管中，加3ml FBS终止消化。 （9）1000rpm离心5mins，吸除上清。 （10）以MEF培养基重悬，同步骤9离心。 （11）再以10mlMEF培养基稀释悬液并接种至10cm培养皿。 (12) 放入37℃，5%CO2 培养箱。 $ ~; S/ p- X, Q. ]0 K要点: 无菌是操作关键, 动物皮毛不能直接或间接接触到子宫, 分离子宫时必须换用另一套无菌的眼科剪和眼科镊。培养同一株胚胎干细胞最好延用相同品系小鼠来源的成纤维细胞。* v) w3 K j! I* h要点: 仔细观察原代细胞有无被杂菌污染的迹象, 并且检测支原体, 确定无污染后传代扩增。, ^2 Q# @??q7 |; L2.MEF传代 需预先准备：37度预温的Trypsin-EDTA。5 u, g8 X- }$ I- w8 k3 ]9 P（1）消化：吸去培养皿中的MEF Medium，用PBS洗涤1次(加10ml)后，加入2ml 0.25%Trypsin/EDTA 37度消化5min。2min时，拿出敲打皿侧壁，使细胞悬起，再放入。% A/ l（注：加PBS洗涤，是为了除去血清，否则胰酶发挥不了作用）4 r2 N; {5 K% A- e（2）终止消化：加入2倍Trypsin体积的 MEF Media终止消化，用吸管冲洗培养面并反复吹吸，使细胞离散成为单细胞悬液。将悬液移入15ml离心管，1000r离心5mins，吸除上清。（3）分装接种：1传3（P0）。用6ml media重悬细胞，吹打均匀。以2ml细胞悬液/每皿加入到已加入8ml media的10cm皿中。 （4）放入37℃，5%CO2 培养箱。 C/ I（5）隔一天，视生长状况传代。3传6（P1），6传18（P2）18（10cm）传18（18cm）（P3）。 每用胰酶消化一次即为一代。 注意: 每次传代尽量把成纤维细胞消化、吹打成单细胞悬液.??细胞悬液总量与皿的直径相一致。6 k: y3 T4 \0 A8 T$ `3.冻存MEF, 需预先准备：37度预温的Trypsin-EDTA。 预冷的MEF冻存液（直接从37度取出融化的冻存液，室温预冷即可） MEF传代之前，取三分之一的dishes继续进行MEF传代操作，另外三分之二进行冻存处理。 （1）吸除培养基（吸除之前摇一摇，以尽量去除死细胞），以PBS（without Ca2+ Mg2+）洗一遍。（PBS均匀滴加，避免将细胞冲起来，10mlPBS/10cm皿） （2）加入trypsin / EDTA （2ml / 100mm dish），放入培养箱消化5mins。2min时，拿出敲打皿侧壁，使细胞悬起，再放入。 （3）加入2倍trypsin / EDTA体积的MEF培养基，轻吹使细胞脱落，将每三个皿的悬液移入15ml离心管，1000r离心5mins，吸除上清。 （4）先加入1.5ml培养基，中档吹打均匀，再加入1.5ml冻存液（冻存液中有对细胞有损害的物质，故后加入），吹打混匀，分装到三管冻存管中。 （5）将冻存管置于已预加250ml常