细胞破碎教学幻灯片讲义.ppt

*;前 言;*;*;1、细胞分离方式; 一些微生物在代谢过程中将产物分泌到细胞之外的液相中，如促红细胞生成素等。这些蛋白质在细胞培养时被宿主细胞分泌到培养液中，提取过程只需直接采用过滤或离心进行固－液分离，然后将获得的澄清滤液再进一步纯化即可。其后续分离和纯化都相对简单。 ★但由于一些重组DNA（rDNA）产品结构复杂，必须在细胞内组装来获得生物活性，如果在培养时被宿主细胞分泌到培养液中，其生物活性往往有所改变，此类rDNA产品是细胞内产品（非分泌型），需要应用细胞破碎技术破碎细胞，使细胞内产物释放到液相中，然后再进行提纯，为后续分离纯化做好准备工作。;*;*;2、细胞壁结构和组成;2、细胞壁结构和组成;*; 革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌细胞壁构造; 虽然几乎所有的细菌都含有基本的粘肽网结构，但革兰氏阳性和阴性细菌的壁结构有明显不同。格兰氏阳性菌的壁相当厚，约15-50 nm，含有40-90%的由基础多糖和磷壁酸质组成的粘肽，一些种属的细胞表面有规律地排列着蛋白质亚基。 革兰氏阴性菌细胞壁由薄的粘肽层(1.5-2.0nm)和在电子显微照片上看如同胞质膜一样的外膜组成，粘肽层上还共价结合有脂蛋白，一些种属在外膜上另外还有一层规律排列的蛋白质亚基。;*;*; 微生物细胞壁的形状和强度与壁内结构聚合物的结构和它们彼此之间交联及与其它组分的交联程度有关。为达到破碎细胞目的，必须打破这种共价结合的网状结构。这种结构不仅与其遗传特性有关，也与其生长环境和生长阶段有关，因此表现为极其丰富的多样性。 利用机械破碎细胞时，细胞的形状和大小，细胞壁结构聚合物的交联程度均是决定破碎难易的重要因素。要预知各种微生物细胞对机械破碎的耐受能力也有困难。;目前已发展了多种细胞破碎方法，以便适应不同用途和不同类型的细胞壁破碎。 破碎方法可规纳为机械法和非机械法两大类。 ;*;*;*;*;*;*;匀浆机配套冷却装置;*;*;*;超声破碎仪CPX-600型;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*;*; 5、复性 将S-200凝胶层析收集液过Sephadex G-25凝胶柱（Φ20cm?40cm, 粒径50-150μm），检测器波长为280nm ,洗脱液为50mmol/L PB-0.05％SDS(G-25凝胶层析洗脱液)，收集第1色谱峰。 用50mmol/L PB-0.05％SDS(G-25凝胶层析洗脱液)将G-25凝胶层析收集液进行稀释，室温搅拌20+2小时，恢复蛋白活性。;*;*;*;谢谢！