[理学]3-1基因工程的主要技术与原理-核酸分离电泳.ppt

（六） 凝胶中DNA的回收 现一般采用试剂盒回收。 存在的主要问题： 不能有效的回收大片段DNA 不能有效回收少量DNA 二、 聚丙烯酰胺凝胶电泳polyacrylamide gel electrophoresisPAGE 在四甲基乙二胺(TEMED)催化过硫酸铵还原产生的 自由基的存在下，丙烯酰胺单体的乙烯基聚合形成聚 丙烯酰胺的线状长链。 （一） 聚丙烯酰胺凝胶的本质 在双功能交联剂如N，N′-亚甲双丙烯酰胺的参与 下的共聚合反应中，聚丙烯胺的交联形成三维带状 网格结构。 网格孔径的平均直径决定于丙烯酰胺和双功能交联 剂的浓度。 CH2=CH-C(O)-NH2 (丙烯酰胺） CH2=CH-CO-NH-CH2-NH-CO-CH=CH2 （N，N`-亚甲双丙烯酰胺） （二） 聚丙烯酰胺凝胶电泳种类 1.变性聚丙烯酰胺凝胶 用于单链DNA片段的分离或纯化、DNA测序 反应等。 变性的DNA在这些凝胶中的迁移率几乎与其 碱基组成及序列完全无关，只与分子大小有关。 2.非变性聚丙烯酰胺凝胶 迁移率受其碱基组成和序列的影响。 用于双链DNA片段的分离和纯化、制 备高纯度的DNA片段。 （三）DNA在聚丙烯胺凝胶中的有效分离范围 丙烯酰胺浓度（%） 有效分离范围（bp） 二甲苯氰FF 溴酚蓝 3.5 1000~2000 460 100 5.0 100~500 260 65 8.0 60~400 160 45 12.0 50~200 70 20 15.0 25~150 60 15 20.0 5~100 45 12 注:N,N`-亚甲双丙烯酰胺的浓度为丙烯酰胺的1/30; 聚丙烯酰胺凝胶装置 三、 脉冲场凝胶电泳pulsed-field gel electrophoresisPFGE 1984年，Schwartz和Cantor发明 （一） PFGE 工作的基本原理 该法可分离长至107bp的DNA分子。严格说来， 应叫交替电场凝胶电泳。 这种电泳是在两个不同方向的电场周期性交替 进行的。DNA分子在交替变换方向的电场中作出 反应所需的时间取决于它的大小。 B+ A- +A -B 脉冲电场电泳示意图 （二）PEGE类型 垂直脉冲场电泳系统(vertical pulsed field) 场翻转系统(field inversion) 旋转胶系统(rotating gel) 箝位匀强电场系统(contour-clamped homogeneous electric field) A- +A B- +B 垂直或横向交变系统 场翻转系统 箝位匀强电场系统 旋转胶系统 A- +A B- +B A- +A B- +B - + （三） 影响分辨率的因素 1.脉冲时间(0.1s-1000s)：增加脉冲时间分离较 大分子，减少脉冲时间分离较小分子。 2.电压：若固定脉冲时间，增加电场强度就增大 了可分离最大片段的范围，但是太大的电场强度 会导致较小片段泳动的紊乱。 3.电场夹角：电场方向的夹角常为1100-1200， 研究证实900夹角也非常有效的。 4.温度：标准琼脂糖电泳基本在室温进行，PFGE 一般应在4℃进行。较高的温度DNA泳动较快；但 是较高的温度也引起较小片段的泳动截留和明显 的条带变宽。 本节要点： 载样缓冲液的作用； CTAB法提取DNA的原理； SDS法提取DNA的原理； 大肠杆菌质粒DNA三种提取液的作用； 控制潜在的RNA酶活性的方法； DNA的迁移速率决定因素 聚丙烯酰胺凝胶的本质 PFGE工作的基本原理 （二）RNA的抽提和纯化 1)??酚-异硫氰酸胍抽提法： 异硫氰酸胍(GIT)与b-巯基乙醇共同作用可抑制 RNase活性； GIT与十二烷基肌氨酸钠共同作用可使蛋白质变 性，从而释放RNA； 在酸性条件下，DNA极少发生解离，而是同蛋白 质一起沉淀，RNA则保留在上清液中而得到分离； 2)??硅胶膜纯化法： RNeasy试剂盒由Qiagen公司设计，其设计思路与 DNA纯化思路相似； 当含有目的RNA的细胞破碎液通过硅胶膜时，RNA 被吸附在硅胶膜上，从而与其它成分分开； 在低盐浓度条件下，RNA被洗脱液洗脱下来； （三）mRNA的纯化 Northern杂交可以使用总RNA,而构建cDNA文库 时，则必须得到纯化的mRNA； 亲和层析法分离mRNA:利用真核生物mRNA3‘端的 poly(A)尾巴可被oligo(dT)-纤维素吸附，已开 发出许多用于mRNA纯化的层析柱。 RNA电泳结果 28S rRNA 18S rRNA 三、核酸的评价