[研究生入学考试]酶学及酶工程课3章2节.pptVIP

酶学及酶工程 Enzymology and Enzyme Engineering 第三章 酶的结构与功能 第二节 酶的溶液构象测定 一、多维核磁共振（NMR)技术 多维NMR是测定溶液蛋白质分子三维结构的方法。 1971年比利时Jeener首次提出二维核磁共振概念。 80年代末开始以二维异核核磁共振测定13C，15N标记的蛋白质。 90年代Bax等提出异核三维和四维核磁共振方法。 现精度可达2埃分辨率。 多维核磁共振的基本原理 NMR是以自旋量子数I=1/2的1H，13C，15N等原子的核为探针，检测蛋白质结构信息。 在外加静磁场（H0）作用下，自旋量子数不为0的原子核发生能级分裂。当同时将射频磁场H1作用其上，如频率满足关系式：ω＝γH0时，原子核吸收射频磁场能量由低能级跃迁到高能级，称核磁共振现象。其中γ为旋磁比，不同原子核的旋磁比不同，共振频率不同，而有氢谱，碳谱，氮谱之分。 多维核磁共振的基本原理 在多维NMR实验中是以一串特定时间间隔的90°，180°……等脉冲方式将H1作用到蛋白质样品上。 90°脉冲作用期间满足共振频率条件时，原子核吸收射频磁场能量。脉冲关闭后弛豫机制使核由高能态回到平衡态，垂直方向接受线圈会感应出高频衰减信号，检波后再经傅立叶变换，形成核磁共振波谱。其中包含丰富的蛋白质分子结构有关信息，可以正确地测定蛋白质的二级结构和三级折叠。 波谱参数： 1）化学位移 谱线化学位移来自于核外电子屏蔽作用。以系数σ描述所受屏蔽，共振条件公式变为： ω＝γ（1－σ ）H0 ，σ与分子结构及原子核所处化学环境有关。同一类氨基酸中1H，15N和13C位于不同二级结构和三级折叠中时，其谱线产生相应的化学位移。所以它们共振波谱的化学位移反映了蛋白质三维空间结构及局部微环境。 化学位移 相对无规卷曲，α螺旋中α质子化学位移向高场方向偏移0.39（标为＋1），β折叠中α质子化学位移向低场方向偏移0.37（标为－1）。根据一级结构中α质子＋1或－1密集情况可推断α螺旋和β折叠域。13C化学位移也有类似情况。 综合1Hα，13Cα，13Cβ和13C’等4组化学位移情况，可较明确判断α螺旋和β折叠，正确率可达92％。 波谱信息：2）J 耦合常数 核磁距通过电子云间接传递作用产生能量耦合，反映被测核与周围原子核之间通过成键电子传递的磁相互作用。该耦合改变被测核共振条件，使谱线分裂为多重峰。谱线各分量距离表示耦合的强弱，定义为J耦合常数(Hz)。J耦合常数可用来描述蛋白质主链及侧链的构象。 波谱信息： 3）NOE NOE，即欧沃豪斯效应，反映原子核自旋之间的偶极-偶极相互作用。蛋白质分子中1H-1H距离小于5?，核磁共振氢谱中就可观察到NOE信号，强度和质子间距离6次方成反比。所以NOE信号强度提供了蛋白质中氢原子对之间的距离信息。 NOE 各二级结构给出的NOE信号具有不同特征。α螺旋相邻残基的酰胺质子间产生强NOE，酰胺氢和α氢、β氢之间产生不同强度的NOE ，氢键产生弱NOE 。 反平行折叠中，相邻酰胺氢和α氢产生强NOE ，酰胺氢之间产生弱NOE ，反向链酰胺氢之间，与α氢之间等产生中NOE ，而平行折叠中NOE信号的出现规律又不相同。该信号可给出丰富信息。 多维核磁共振实验 蛋白质分子量的增加造成共振波谱加宽和重叠，无法提取结构信息。多维核磁共振克服了该困难，提供了多种有效获得结构信息的实验。 多维NMR共振信号是多个频率变量的函数，可有二维、三维或四维频率坐标轴。实验中由专门设置的射频脉冲序列作用，耦合的核发生磁化强度转移或耦合相互作用而交换信息，用以建立化学位移，J耦合常数及NOE相关的信息。 脉冲序列包括弛豫延迟时间、准备周期、演化周期、混合周期、检测周期，多次重复。 核磁化转移机制 1）磁化强度相干转移：耦合核之间通过成键电子传递磁化强度而交换信息。 2）磁化强度非相干转移：核之间通过空间的偶极相互作用而交换信息。 多维核磁共振方法中，大多数脉冲序列基于磁化强度相干转移，建立1H，13C，15N之间化学位移相关和J耦合常数信息。少数脉冲序列基于磁化强度非相干转移而建立NOE相关。 二维同核（1H-1H）COSY实验 基于磁化强度相干转移机制。 弛豫延迟时间使氢核自旋回到热平衡态(Ix)；准备周期（第一个脉冲）置其非平衡态(-Iy)；演化周期按设置的间隔时间顺序递增，不同的氢核以不同频率共振而有不同的化学位移标记；混合周期（第二个脉冲）内不同氢核自旋间产生相干转移；在检测周期测得自由衰减信号FID，经傅立叶变换得到共振波谱。 二维同核（1H-1H）COSY实验 二维异核（1H-13C，1H-15N）HMQC实验 分子量增加时同核实验灵敏度急剧下降，采用异核实验解决。 本实验也基于磁化强度相干转移机制。 氢通道