[医学]第18章 高效液相色谱1.ppt

石英窗 接色谱柱 UV 光电 倍增管 废液 1、紫外检测器 对流量和温度波动不敏感 适于制备色谱 可用于梯度洗脱 最常用的通用型检测器 用于有紫外吸收的物质检测 可变波长检测器 光电二极管阵列检测器 2、荧光检测器 灵敏度高 选择性好 样品量小 适合药物和生化样品分析 用于能产生荧光的物质检测 接参比电极 和对电极 接色谱柱 Teflon 塑料块 1 cm 工作电极 (Pt, Au, 碳糊) 3、电化学检测器 电导检测器： ——用于离子检测 用于检测具有电活性的物质 安培检测器： ——用于检测具氧化还原活性物质 4、蒸发光散射检测器 适于无紫外吸收、无电活性和不发荧光的样品检测 通用型检测器 组分挥发性低于流动相 灵敏度较低 不能含有缓冲盐 检测器类型 品种个数 紫外检测器 1333个 蒸发光散射检测器 28个 示差检测器 10个 电导检测器 5个 2010版药典二部采用检测器情况 五 、 数据处理和计算机控制系统 色谱工作站 在线显示 自动采集 处理储存 自动控制 粒径小、颗粒分布均匀 传质快、渗透压小 机械强度高、能耐高压 化学稳定性好 第三节、HPLC的固定相和流动相 一、固定相 要求： 载体 硅胶：用于吸附、分配和键合色谱 聚合物：用于离子交换和尺寸排阻色谱 以硅胶为载体，借化学反应方法将有机分子以共价键连接在硅醇基上。 （一）化学键合固定相 Si-O-R： 热不稳定、易水解，适于不含水或醇的流动相 Si-R(或Si-N)： 不水解，热稳定性较好。pH4-8之间对水稳定。 Si-O-Si-R： 不水解，热稳定性好，pH2-8范围内对水稳定 （一）化学键合固定相 非极性键合相： 用于反相色谱 十八烷基键合相（C18） 辛烷基键合相（C8） 甲基键合相（C1） （一）化学键合固定相 中等极性键合相：用于反相或正相色谱 醚基键合相 二羟基键合相 极性键合相：一般用于正相色谱 氨基、氰基键合相 键合型离子交换剂：硅胶表面键合各种离子交换基团 （二）其它种类固定相 手性固定相：手性官能团键合或天然手性物质固着在载体上如环糊精 亲合色谱固定相：生物专一性配基+载体 二、流动相——淋洗液，洗脱剂 对样品有适宜溶解度， k = 2 ~ 5； 溶剂要与检测器匹配。 高纯度、化学稳定性好 适宜的粘度。过高柱压增加；过低易生气泡 流动相要求 常用的低粘度溶剂：甲醇、乙晴等 粘度过低的溶剂：戊烷、乙醚等 二元或多元组合溶剂可灵活调节流动相极性 常用溶剂: 烷、四氯化碳、甲苯、乙酸乙酯、乙醇、乙腈、甲醇、水。 二、流动相——淋洗液，洗脱剂 流动相使用前须用微孔滤膜过滤除去固体颗粒，还要进行脱气 正相色谱：极性固定相——非极性流动相（加极性调节剂如氯仿）——极性柱（正相柱） 三、固定相和流动相的选择 反相色谱：非极性键合固定相（ODS）——极性流动相——非极性柱（反相柱） 组分在两种类型分离柱上的出峰顺序相反。 流动相可选水或一定pH缓冲液，加甲醇或乙腈调节极性） 正相色谱 低极性流动相 反相色谱 高极性流动相 中等极性流动相 中等极性流动相 时间 时间 时间 时间 待测物极性：ABC 正、反相色谱中极性和保留时间的关系 高效液相色谱法 High Performance Liquid Chromatography 第一节、概述 一、含义 液相色谱 (LC) ：以溶剂液体为流动相的色谱方法 高效液相色谱（HPLC）： 高效能固体细微粒为固定相 高压溶剂为流动相 高灵敏度检测器 二、高效液相色谱与其它色谱方法的比较 1. HPLC与经典LC的比较 经典LC HPLC 固定相颗粒100μm,不均匀 固定相颗粒10μm,均匀 常压下输送流动相 高压下输送流动相 柱效较低（H↑，n↓） 柱效较高（H↓，n↑） 分析周期长 分析周期短 无法在线检测 可以在线检测 2. HPLC与GC的比较 分析对象及范围 流动相的选择 操作条件 GC 适于能气化、热稳定性好、且沸点较低的样品，占有机物的20% 流动相为有限的几种“惰性”气体，只起运载作用，对组分作用小 加温常压操作 HPLC 能制成溶液的样品，不受试样的挥发性和热稳定性限制，占有机物的80% 流动相为液体或各种液体的混合。它除了起运载作用外，还可通过溶剂来控制和改进分离。 室温、高压下进行 相同：均为色谱分析方法，兼具分离和分析功能，均可以在线检测 按固定相的聚