[医学]第七组.ppt

生技大实验综合展示;1.单元一:目的基因的提取2.单元二:目的基因的连接转化及重组子筛选3.单元三:重组DNA在大肠杆菌中的诱导表达4.单元四:重组蛋白的分离纯化及检测;实验原理;实验结果;电泳检测RNA完整性 ;RT-PCR琼脂糖凝胶电泳 ;单元二：目的基因的连接、转化及重组子筛选;实验原理：;3.蓝白斑筛选;;双酶切鉴定;实验结果;空载质粒的摩尔数=3×10-15mol 插入DNA片段的摩尔数=1.933×10-12mol 空载质粒的摩尔数：插入DNA片段的摩尔数≈1:1000，该比值远小于1:2到1:10的范围，待插入DNA片段过多，当时未稀释待插入DNA，直接进行了转化实验，导致实验组和对照组菌落密度偏大。;空载质粒转化效率计算如下： 1μl5ng/μl即5ng的质粒加入2号100μl 感受态细胞EP管中，取50μl加LB/Amp/IPTG/X-Gal平板，最后加入玻璃珠，摇动混匀涂布平板，第二天记录蓝色菌落共计6000，此时转化效率=6000cfu/ （ ×5ng）=2.4×103cfu/ng=2.4×106cfu/μg质粒;;2.菌落PCR产物琼脂糖凝胶电泳;3.KpnI / Xba I 双酶切琼脂糖凝胶电泳示意图;单元三;实验原理——乳糖操纵子的调控机制 ;实验流程;紫外灯下（UV365nm）1# -5#管观察结果 ;;实验结果分析;单元四;实验原理; PAGE胶配置、保存（每组配两块）;1.亲和层析;2.SDS凝胶电泳; 　　从上图可以看出，marker条带位于最左端，marker泳道中10KD和17KD两条带几乎重合，但还是可以看出上面的蓝色及下方的绿色条带； 　　7号泳道GFP条带最深最宽，位于26-34KD左右，该结果与其约27KD的分子量相符，其条带又深又宽，与其经过300mM咪唑洗脱纯化的实验过程相符； 　　6号泳道为经50mM咪唑洗脱，可以看出许多其他条带及隐约的一条GFP条带，证明有少量GFP被洗脱； 　　5号泳道为杂蛋白，为层析时的穿流峰，含有许多不同分子量的条带，但不含GFP； 　　4号泳道为离心上清，由于超破后离心，上清中含有许多蛋白，包括GFP，因而电泳结果中不仅含杂蛋白，也含GFP； 　　1、2、3号泳道分别为重组大肠杆菌GFP的本底水平表达、葡萄糖降解物阻遏效应后的表达及诱导表达，因而只有3号泳道有GFP的出现，当然，1、2、3号泳道还有其他杂蛋白的表达，上图中可以看出几条隐约出现的细细的条带。;3.Western-Blot;