[生物学]4核酸化学.ppt

第四章 核酸化学 变性DNA 的复性 热变性DNA缓慢冷却 可以复性 称为退火 增色效应 减色效应 DNA的变性与复性 核酸的分子杂交 分子杂交技术 利用DNA变性与复性的原理 变性DNA复性重新形成双螺旋结构 不同的DNA单链分子或者DNA与 RNA的混合物 形成杂化的双链 印迹技术 存在于凝胶中的生物大分子 转移(印迹)于固定化介质上并加以检测分析的技术 常用的印迹技术 DNA印迹技术、RNA印迹技术、蛋白质印迹技术 DNA印迹技术主要用于基因组DNA的定性和定量分析 RNA印迹技术可以用来确定特异RNA的大小,半定量分析 免疫印迹技术用于检测特异蛋白质的存在、半定量分析 印 迹 技 术 示 意 图 探针技术 是经过特殊标记的核酸片段， 它具有特定的序列， 能够与待测的核酸片段互补结合， 因此可用于检测核酸样品中的特定基因 常用探针 探针 DNA探针 RNA探针 四、核酸的分离、纯化和鉴定 一般原则 一般根据核酸来源和种类不同而选择不同的方法， 但总的要求是除去蛋白质等各种杂质， 保持核酸不发生变性或降解， 最终得到完整而具有天然生物活性的核酸制品 提取核酸主要步骤 ①实验材料的获得，包括细菌、细胞的培养或组织器官提取 ②收集和裂解组织或细胞，释放出核酸 ③核酸的分离和纯化 保持低温(0～4℃) 避免剧烈的机械作用 分离核酸的一般过程 抽提和沉淀核酸 细胞组织破碎 → 解聚核蛋白并使蛋白质变性 → 去除蛋白和多糖等杂质 → 根据所需纯化的核酸性质确定纯化方法 DNA的分离纯化 除蛋白方法 真核细胞中DNA以核蛋白形式存在 去垢剂法 十二烷基硫酸钠(SDS)等去污剂可使蛋白质变性 苯酚抽提法 使蛋白质迅速变性 抑制核酸酶对DNA的降解 三氯甲烷-戊醇抽提法 酶法 分离不同构象的DNA 蔗糖梯度区带离心法 按照DNA分子量的大小和形状进行分离 氯化铯密度梯度平衡超离心法 羟基磷灰石和甲基白蛋白硅藻土柱层析 RNA的分离与纯化 核酸纯度鉴定 紫外吸收法 定磷法 定糖法 核糖的测定 地衣酚(3,5-二羟甲苯)反应 脱氧核糖的测定 与二苯胺反应 试设计方案分离这三种蛋白质 复习题 1、在一抽提液中含有三种蛋白质 A B C 分子量 20,000 21,000 5,000 等电点 8.5 5.9 6.0 2、有两个DNA分子，如果发生热变性，哪一个分子Tm值高？ 如果再复性，哪一个DNA复性到原来的DNA结构可能性更大些? ① 5’ATATATATAT3’ 3’TATATATATA5’ ②5’TAGGCGATGC3’ 3’ATCCGCTACG5’ 3、说明在pH2.5、pH3.5、pH6、pH8、pH11.4时， 四种核苷酸（AMP、GMP、CMP、UMP）所带的电荷数 （或所带电荷数多少的比较）； 电泳分离四种核苷酸时，缓冲液应取哪一个pH比较合适？ 此时他们是向正极还是向负极移动？移动的快慢顺序如何？ 4、从组成、结构、性质、功能几方面比较两类核酸的异同点 * * 一、核酸的种类、分布和化学组成 核糖(核蛋白)体RNA ，约占细胞总RNA的80% 转移RNA，约占细胞总RNA的10%～15% 信使RNA ，约占细胞总RNA的5% 元素组成 核苷酸的结构 DNA ，98%在核中，少量在核外、线粒体 核酸 → 核苷酸 碱基 互变异构 戊糖 核苷 部 分 核 苷 的 结 构 核苷酸 细 胞 内 游 离 核 苷 酸 及 其 衍 生 物 环化核苷酸 二、核酸的分子结构 核酸的一级结构 核苷酸序列都是按照5→3方向读写 pApTpCpApG 字母简化式 线条简化式 一级结构测定 片断重叠法（经典法） 用酶降解核酸成片断，测各段组成及序列 找出重叠片断，推断整个序列 再用另一种酶降解核酸，测各段组成及序列 直读法（化学断裂法） 用同位素标记（5’-OH）， 降解， 电泳分离， 放射自显影， 图谱中推测序列 DNA的二级结构 DNA分子的碱基组成特点 A=T G=C A+G=C+T 不同生物来源的DNAA+T/G+C比值的不同 同一生物的不同组织的DNA碱基组成相同 DNA碱基