CHIP实验流程图(CST9002).doc

CHIP实验流程图（CST9002） 第一天 A体内交联，细胞核制备并用核酸酶S7消化染色质 B. 分析染色质的浓度和酶切情况（推荐步骤） C. 染色质免疫沉淀 第二天 D. 漂洗免疫沉淀的染色质： E. 将染色质从抗体/蛋白G微球上洗脱并解交联 F. 用离心柱纯化DNA。 G. 实时定量PCR方法： 建议： 实验中使用带滤芯的枪头以尽可能减少污染的可能性。 试剂盒中所包含的对照引物特异性识别人或小鼠的RPL30基因，既可以用于常规PCR也可以用于实时定量PCR。如果用户做的ChIP样品来源于其它他物种，建议客户设计合适的特异对照引物并优化PCR反应条件。 建议使用热启动Taq聚合酶以减少产生非特异PCR产物的风险。 PCR引物的选择很关键。引物应尽可能按照下列标准来设计： 引物长度: 24个核苷酸 最佳Tm值： 60°C 最佳GC含量: 50% 扩增片段长度： 150-200 bp（用于常规PCR） 80-160 bp （用于实时定量PCR） 实时定量PCR方法： 选与所用定量PCR仪配套的PCR管或板，做好标记。注意加入阳性对照组蛋白H3样品组，阴性对照正常兔IgG样品组，以及监控DNA污染的不加DNA模板的空白组对照。另外在加入反应体系前，将2%样品输入对照做一系列稀释（不稀释，1：5，1：25，1：125），据此可以产生标准曲线并测算PCR扩增效率。 在每个反应管或孔（板上）中加入2 μl相应DNA模板。 按下面配比配置PCR反应液总管，记住计算时多算两份以补偿分管时的体积损失。配好后，向每个PCR管中加入18 μl反应液混合物。 试剂 每个PCR反应（20 μl）所需体积 无核酸酶的水 6 μl 5 μM RPL30 引物 2 μl SYBR-Green反应体系 10 μl 按下面程序执行PCR： a. 预变性 95°C 3 分钟 b. 变性 95°C 10 秒 c. 退火及延伸： 60°C 30 秒 d. 重复第2及第3步，共40个循环 用定量PCR仪自带的程序分析定量结果。 2个10cm培养皿（90%）+10ml培养基 额外一盘细胞用于测定细胞数 预热的试剂：200X蛋白酶混合抑制剂 1 M的二硫苏糖醇 0.1 M PMSF 10X ChIP缓冲液（确认SDS已完全溶解） 准备：50ml离心管 4个 1.5ml EP 7个 水浴锅 37°C 15ml离心管 4个 台式冷冻离心机 4°C 配液并预冷：10X 甘氨酸溶液 10 ml 1X PBS 200 ml 1mMPMSF：1X PBS 30 ml PMSF 300 μl 1X缓冲液 A4X缓冲液A2.5 ml 水7.5 ml 1 M DTT 5 μl 200X PIC 50μl 0.1MPMSF 100 μl 1X 缓冲液 B4X 缓冲液B ml 水 ml 1 M DTT 5.5 μl 1X ChIP缓冲液10X ChIP缓冲液125 μl 水125 μl 200X PIC 6.25μl PMSF 12.5 μl 270 μl 37%的甲醛/10ml培养基、转动混匀，室温放置10min 甲醛的终浓度为 1% 培养基会变色 培养基会变色 1 ml 10X 甘氨酸、转动使之混匀，室温孵育5min 弃培养基、冷PBS漂洗两次（10 ml /次） 彻底弃净PBS 2ml、1 ml冷1X PBS + PMSF依次冲洗合并收集 2 ml冷1X PBS + PMSF、刮下细胞并合并收集 4°C 1500rpm离心5分钟，弃上清 加入3.385 ml冷缓冲液 A + DTT + PIC + PMSF 3min颠倒混匀1次 加入400μl冷缓冲液 + DTT重悬细胞核，将样品转移到1.5 ml离心管 加入3 ml冷缓冲液 + DTT重悬细胞核 4°C 3000rpm离心5分钟，弃上清 上清（交联的染色质）移到新管子中， -80°C保存，取50 μl分析DNA的酶切情况及其浓度 5min颠倒混匀1次，150-900 bp 加入2 μl微球菌核酸酶°C孵育20 min 加入400μ1X ChIP 缓冲液 + PIC + PMSF 加40 μl 0.5