核酸杂交技术教学教材演示幻灯片.ppt

核 酸 杂 交;目的与要求;核酸分子杂交;核酸分子杂交的发展;核酸分子杂交的技术要素;探 针;核酸探针的种类;DNA 探针;DNA探针的优点;cDNA探针;合成的寡核苷酸探针的优点;应用寡核苷酸针的原则;核酸分子杂交的技术关键;核酸探针的标记和检测;核酸探针的常用标记技术;缺口平移标记法;核酸探针的常用标记技术;随机引物标记法;核酸探针的常用标记技术;末端标记法;核酸探针的常用标记技术;核酸探针的常用标记技术;核酸探针的非放射性标记技术;核酸探针的非放射性标记技术;核酸探针的非放射性标记技术;核酸探针的非放射性标记技术;核酸探针的非放射性标记技术;非放射性探针的显示体系;非放射性探针的显示体系;非放射性探针的显示体系;非放射性探针的显示体系;标记物性质;核酸分子杂交的类型;固相膜核酸分子杂交方法;Southern印迹杂交（Southern bloting);高盐下通过毛吸作用将DNA转印至硝酸纤维素滤膜上(凝胶中DNA片段的相对位置在DNA片段转移到滤膜的过程中继续保持着);Northern 印迹杂交（Northern bloting）;斑点杂交（Dot bloting）;原位杂交（in situ hybridization）;固相夹心杂交;原位杂交的基本步骤;2.杂交液的配制 杂交液所含成分除大约2.5 ng/ul的标记探针DNA外，还包括： 50%甲酰胺，是解双螺旋的分子，会破坏氢键的形成，促进DNA和探针变性后，进行杂交； 10%硫酸葡聚糖，形成探针混合液基质，对DNA有浓缩作用，可提高杂交的反应速度10倍以上，但不影响探针的洗脱强度；杂交时常用浓度为5%～10%，但浓度高时会使溶液的粘度增大，不利杂交探针的渗透。 0.1SDS,它有助于探针的渗透; 2×SSC,作为调节探针洗脱强度的缓冲液; 封阻DNA：浓度通常为探针DNA的1～100倍,作用是杂交掉探针中的相似序列，阻止探针DNA与非目标DNA的粘连，即用于阻止探针与非特异位点或非目标DNA杂交。;3.变性及杂交 制片DNA一般用70%去离子甲酰胺于70%下变性2分钟即可。 杂交探针需于70-90℃ 下变性10分钟。 在将探针DNA加到待检测的制片上后需于80-90℃ 下共变性10分钟。 注意：在每次变性后，都需要将样品用冰迅速冷却，以保持变性后单链状态。;4.洗脱 ;5.检测 ;以特异序列为探针鉴定rDNA在染色体上的分布 ;固相膜核酸杂交的几点说明;液??核酸分子杂交类型;液相核酸分子杂交类型;液相核酸分子杂交类型;核酸分子杂交实验因素的优化;核酸分子杂交实验因素的优化;核酸分子杂交实验因素的优化;核酸分子杂交实验因素的优化;核酸分子杂交实验因素的优化;核酸分子杂交实验因素的优化;核酸分子杂交实验因素的优化;核酸分子杂交实验因素的优化;总 结;核酸探针：与特定核酸序列发生地特异互补杂交，杂交后能用特殊方法检测出的一种被标记的核苷酸链 种类：基因组DNA探针；cDNA探针；RNA探针；cRNA探针；人工合成寡聚核苷酸探针 核酸探针的标记：同位素标记；非同位素标记 标记方法：缺口平移法；随机引物法；5‘-末端标记 ;缺口平移原理：先用DNA酶在双链DNA探针分子的一条链上制造一些缺口（nick）, 再在大肠杆菌DNA聚合酶I的催化下将核苷酸残基加在3’－羟基上；利用大肠杆菌酶DNA聚合酶I的5’→3’核酸外切酶活性，将缺口5’侧核苷酸依次切除。其结果即缺口平移（nick translation）；用高强度的放射性核苷酸（通常为α-32PdNTP） 置换先前存在的核苷酸，则可制备比活性高达108cpm（每分钟计数）/μg的32P标记DNA。 随机引物延伸原理：使长6～8nt的寡核苷酸片段与变性的DNA或RNA模板退火，在DNA聚合酶I的作用下，以寡核苷酸为引物、掺入[α-32P]dNTP合成DNA链，即得到标记。因为所用寡核苷酸片段很短，在低温条件下可与模板DNA随机发生退火，因此被称为随机引物（random primer）。随机引物可用小牛胸腺或鱼精DNA制备。 ;应用寡核苷酸针的原则