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本章要解决的问题 第一节 核酸的分离纯化技术 PCR的过程 1、模板DNA的变性 2、单链DNA模板与引物退火 3、引物的延伸 PCR系统的组成及PCR最适条件 4、3’决定引物的特异性，引物3’端不可能有任何修饰。 5、5’决定产物的长度，5’端修饰不但不影响正常PCR反应，反而给PCR产物分析与进一步操作带来方便。 6、引物与非扩增序列同源性不超过70%。 dNTP 浓度根据靶顺序的长度和组成而定,一般使用浓度在20~200umol/L之间。 dNTP有较强的酸性,使用时应以NaOH将pH值调至7.0~7.5分装保存于-20℃冰箱中,过多的冻融会使dNTP降解.贮存液浓度为5~10mmol/L。PCR循环中dNTP浓度增高会加快反应速度，但同时增加碱基的错误掺入率。另外，如果一种碱基明显高于其它几种，错误掺入增加。 dNTP能和Mg2+结合，故应注意 dNTP和Mg+浓度之间的关系。 三磷酸脱氧核苷酸(dNTP) PCR反应缓冲液 Tris-cl(pH 8.3~8.8) 、 kcl 、Mgcl2 Mg2+最为关键，它是TaqDNA聚合酶所必须，PCR中Mg2+加入量需比dNTP浓度高0.2~0.5mmol/L,最好对每种模板、每种引物进行优化。 模板 类型：DNA和RNA 来源：培养细胞、微生物、临床标本、犯罪现场标本 PCR的循环次数 PCR的循环次数取决于模板DNA的浓度。理论上说25次循环后，PCR产生的积累即达最大值。实际操作中由于每步反应不可能达100%效率，所以30次是比较合理的循环次数。 易发生的问题及解决办法 1、没有得到所希望的PCR产物（假阴性）：①是否加入TaqDNA聚合酶，酶活性如何？②DNA解链是否充分？用仪器操作时是否达到解链温度（往往是失败的主要原因③样品中可能有酶抑制剂，用95℃加热使其失活④使用多组引物，作双PCR 2、所有样品均为阳性（假阳性） ①设立阴性对照、空白对照 ②样品收集、处理时避免污染 ③避免阳性样品对检测样品污染 3、PCR产物呈片状： ①减少聚合酶浓度 ②增加退火温度 ③减少循环周期 4、出现非特异性扩增产物： 基因组DNA作为模板时，由于其数量的庞大及结构的复杂，除了特异扩增外，往往容易产生非特异扩增。试用以下办法： ①增加退火温度、减少退火时间及延伸时间②降低TaqDNA聚合酶浓度③改变Mg2+浓度 生物芯片技术 生物芯片技术：指在固相支持物上原位合成寡核苷酸或直接将大量DNA探针以显微打印的方式有序地固化在支持物表面,然后与标记过的探针杂交,通过对杂交信号的分析,得出标本的遗传信息。 DNA芯片别名：基因芯片、DNA阵列、寡核苷酸阵列。 基因诊断 基因诊断的步骤: 1、基因组DNA的提取与纯化 2、限制性内切酶作用 3、琼脂糖凝胶电泳 4、southern-blotting 转移分离片段 ５、与探针杂交 已知点突变的检测 　目前发现的遗传病中，绝大部分只是单纯的碱基突变引起的，而且每一种遗传病都有一些突变位点。点突变可以通过酶切图谱分析、寡核苷酸探针杂交法、ＰＣＲ检测等进行。 酶切图谱分析：镰刀形红细胞贫血，其珠蛋白β链Ｎ端第６位谷氨酸被缬氨酸所取代，成为HbS.突变发生在β珠蛋白基因 　５‘端第１７位碱基Ａ被Ｔ所取代．内切酶MstⅡ能识别并切割ＣＣＴＧＡＧＧ，正常血红蛋白的βＡ基因及５’侧翼区经MstⅡ酶切产生1.15kb和0.2kb 片段；而βs基因由于ＣＣＴＧＴＧＧ序列不能被MstⅡ酶酶切，所以酶切位点的丢失产生了1.35kb片段． 寡核苷酸探针杂交法 已知基因突变，人工合成相应于突变基因的异常寡核苷酸序列作为探针（一般为１９聚核苷酸），直接在凝胶板上进行分子杂交进行检测和鉴定突变基因，这就是寡核苷酸探针杂交。 ＰＣＲ结合酶切图谱和等位基因寡核苷酸探针斑点杂交基因分析 １、确定突变位点 ２、ＰＣＲ扩增含突变位点的基因序列 ３、限制性酶切图谱分析 ４、寡核苷酸探针杂交 未知点突变的检测 ＰＣＲ－ＳＳＣＰ聚合酶链-单链构象多态性分析 基因缺失的检查 ＰＣＲ－ＲＦＬＰ 生化检验技术重点内容 １、朗伯一比耳定律原理及适应条件？ ２、分光光度法的测定原理及定量方法？ ３、分光光度计正确使用方法？（使用时要注意哪些事项？） ４、电泳法的原理？电泳速率影响因素？用途？ ５、醋酸纤维素薄膜电泳特点？聚丙烯酰胺凝胶电泳特点？ 电泳法定量的方法？原理及操作？ 层析法的概念？ 自动生化分析仪校准方法？Ｋ因素法中Ｋ因素怎样计算？ 自动生化分析仪的主要参数有哪些？分析方法种类及各自特点？ 酶活性测定的原理？ 酶的活性国际单位定义 何谓零级反应？线性反应期？ 什么是米曼氏方程，有什么用途？ 酶活性测定的方法？什么是固定时间法？什么是连续监测法？各自特点？