[医学]第十章 电泳-2.pptVIP

2.4 不连续垂直板凝胶电泳 ?基本原理 、操作方法，溶液配制等均与不连续垂直柱状凝胶电泳相同 ?区别：板状支持物 优点： ?面积大 ?易取胶 ?可一次点多个样品 ?可作双向电泳 第三节 琼脂糖凝胶电泳 广泛应用于核酸研究中： ? DNA片段分子量的测定； ? DNA分子构象的分析 3.1 原理： ?碱性环境中，DNA分子带负电荷，在电场中向正极移动； ?电泳速度与Mr有关－－测定Mr的依据； ? 凝胶介质还有分子筛效应。 所以，不同分子量、构象的DNA片段，电泳后出现迁移率不同。 3.2 琼脂糖凝胶电泳的操作 3.2.1 缓冲液的配制 分离双链DNA的缓冲液： ? Tris－乙酸（TAE）：pH7.5－8.0，缓冲容量低，不能 长时间电泳 ? Tris－硼酸（TBE）：pH8.3 ? Tris－磷酸（TPE）：pH7.5－8.0 配制缓冲液时，要加入适量EDTA，以除去二价金属离子 3.2.2 琼脂糖凝胶板的制备 （1）称取一定量琼脂糖，加所需的电极缓冲液－－加热－－熔化→混匀－－冷却至60℃ －－加入EB （2）水平板型电泳槽 封制胶膜：用琼脂糖封闭玻璃板与模框连接处 →加梳子→倾注凝胶液（3mm厚）→室温放置，待凝固 →拔出梳子/模框 3.2.3 加样、电泳 ?将琼脂糖凝胶板移至水平式电泳槽中，注入缓冲液，使液面高于胶面； 观察结果 第四节 变性聚丙烯酰胺凝胶电泳 在PAGE系统中，加入适量SDS、尿素或SDS－尿素，这样的凝胶电泳称为变性PAGE电泳。 简称：SDS主要用于测定蛋白质及其亚基的相对分子量 4.1 基本原理 ? SDS－PAGE分离样品的主要依据： 蛋白质Mr的差异 1、SDS的作用： ? SDS带大量负电荷，它与蛋白质结合后，SDS－protein复合物带负电荷 ? ∴各种SDS－protein在电泳时产生的泳动率的差异，反映了蛋白质分子量的相差 2、 解聚作用： 在蛋白质溶液中加入SDS和疏基乙醇： ?疏基乙醇是强还原剂，能还原蛋白质分子中的二硫键，蛋白质分子被解聚，SDS结合到蛋白质分子上去； ? SDS还能打开蛋白质的氢键、疏水键，结合到protein上，形成SDS－protein； ? SDS-蛋白质具有相同的构象。 4.2 操作 1、可采用垂直柱型电泳，或垂直板型电泳 2、制胶：Acr：Bis＝29：1 用含0.1％SDS的0.1mol/L的磷酸buffer配制凝胶 3、样品准备： ?样品溶于含1％SDS、0.1％巯基乙醇的0.01mol/L的磷酸buffer中； 处理：100°C水浴，密闭2~5min， 或37 °C，6hr，（温和变性法，可复性） ?标准蛋白标准品：配成2－5mg/ml的蛋白质浓度； 细胞色素C 胰凝乳蛋白质酶原 胃蛋白酶 卵清蛋白等 4、电泳： （电极液：0.1％SDS－0.1mol/L磷酸缓冲液，pH=7.2） 5、固定、染色 ?固定、除SDS：10％三氯乙酸中→过夜 ?染色：0.02％－0.05％考马斯亮兰→脱色 6、计算相对迁移率Rf 样品迁移距离 Rf＝ 染料迁移距离 （溴酚兰） 7、作图，计算Mr 以标准蛋白迁移率Rf为横坐标，相应的lgMr为纵坐标，绘制标准曲线； 计算样品Mr。 第五节 等电聚焦电泳 等电聚焦（isoelectric focusing， IEF）是20世纪60年代发展起来的一种高分辨率的蛋白质分离、分析技术。 5.1 基本原理（蛋白质聚焦） 蛋白质为两性电解质，不同的protein的pI不同。 在不同的pH环境中，带电粒子在电场中迁移方向不同。 最后聚焦于pI处（电荷为零） 原理： ?在电泳支持介质（凝胶）中加入载体两性电介质 ?通直流电后在正负极之间形成稳定、连续、线性的pH梯度 ∴protein分子在pH＝pI处被聚焦成窄而稳定的区带。 无论蛋白质样品处于电泳介质中何位置，在电场作用下，都会聚焦在pH＝pI的地方－－这种行为称为聚焦作用。 也可用此方法测protein的pI 5.2 pH梯度的产生方式 自然pH梯度：将载体两性电解质加入凝胶中，在电场作用下，自然形成pH梯度，凝胶具有防对流扩散的作用，使pH梯度保持稳定。 5.3 载体两性电解质 种类： 瑞典LKB公司生产，商品名为Ampholine； 瑞典pharmacia公司生产，称为pharmalyte。 5.3.1 载体两性电解质的性质 1、载体两性电解质为略带黄色的水溶液，浓度一般为40％，4℃ 保存，pH＝3－1