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HPLC Modes 排阻色谱技术 操作与原理：含有不同组分的溶液，通过网状结构的凝胶粒子(a)，小分子扩散进入凝胶相，大分子被排阻于凝胶相外，加入洗脱剂后溶液向下推移，大分子及剩余的小分子进入下层新的凝胶相中，重复上述扩散和排阻。这样最先流出的为最大的分子，最后流出的为最小分子，分段收集可以获得按分子量大小分布的各组分。 分子筛色谱: 从上可见，凝胶过滤具有分子筛的作用。 2．固定相 所谓凝胶，指含有大量液体（一般是水）的柔软而富于弹性的物质，它是一种经过交联而具有立体网状结构的多聚体。 凝胶色谱固定相种类很多，一般可分为软性、半刚性和刚性凝胶三类。 （1）软性凝胶 如葡聚糖凝胶、琼脂糖凝胶都具有较小的交联结构，其微孔能吸入大量的溶剂，并能溶胀到它们干体的许多倍。它们适用以水溶性溶剂作流动相，一般用于小分子质量物质的分析，不适宜用在高效液相色谱中。 （2）半刚性凝胶(如高交联度的聚苯乙烯)：比软性凝胶稍耐压，溶胀性不如软性凝胶。常以有机溶剂作流动相。用于高效液相色谱时，流速不宜大。 （3）刚性凝胶(如多孔硅胶、多孔玻璃等):它们既可用水溶性溶剂，又可用有机溶剂作流动相，可在较高压强和较高流速下操作。 1st 表面惰性，不发生化学和物理变化； 2nd 高稳定性，有较宽的pH适应范围； 3rd 具有一定的孔径分布； 4th 机械强度高，耐高压操作。 对凝胶介质的要求： 排阻极限：指不能扩散到凝胶网络内部的最小分子的M。如，Sephadex G50的排阻极限为30kD。 分级范围：能阻滞组分并且使组分相互之间得到分离的组分分子量范围。如， Sephadex G50的分级在1.5-30KD内。 凝胶介质特征参数 凝胶粒径：软gel粒径较大，在50-150?m之间；硬gel较小，在5-50?m之间。粒径越小，板高越小，分离效率越高。 床体积(bed volume)：1g干燥gel溶胀后所占有的体积。如， Sephadex G50的床体积为9-11 cm3/g干胶。 空隙体积(void volume)：凝胶之间的空隙体积，即V0。 3．流动相 必须能溶解样品，并必须与凝胶本身非常相似，这样才能润湿凝胶。 溶剂的粘度要小。这对于具有低扩散系数的大分子物质分离，尤需注意。 选择溶剂还必须与检测器相匹配。常用的流动相有四氢呋喃、甲苯、氯仿、二甲基酸胺和水等。 以水溶液为流动相的凝胶色谱适用于水溶性样品，以有机溶剂为流动相的凝胶色谱适用于非水溶性样品。 凝胶过滤色谱 凝胶渗透色谱 通用型检测器：适用于所有高聚物和有机化合物的检测。有示差折光仪检测器、粘度检测器。 选择型检测器：适用于对该检测器有特殊响应的高聚物和有机化合物。有紫外、红外、荧光等。 4. 检测系统 联用技术 把凝胶色谱仪与光散射仪连用，由光散射仪连续测定聚合物样品中各个级分的相对分子质量，由凝胶色谱仪中的浓度示差检测器检测各个级分的浓度，就可以得到各种聚合物的平均相对分子质量和浓度。 5 优点 与其他色谱相比，操作简便，固定相价廉易得；适合于大规模生产； 待分离组分和固定相不发生任何形式的相互作用，故操作条件温和，回收率接近100%；固定相与分子间的作用力极弱，趋于零，柱寿命长。 作为脱盐手段，凝胶色谱比透析法速度快，精度高；与超滤相比，剪切力小，蛋白质的回收率高。 不能分辨分子大小相近的化合物。一般说来，分子量的差别需要10%以上时才能得到分离； 分离仅限于分子量的差别，选择性低； 经凝胶色谱洗脱后，产品被稀释。因此需浓缩单元操作。 缺点 6 应用 M：x0-106； d: 0.x-x00nm之间； 种类：肽、脂质、抗生素、糖、核酸、病毒。 1) 分离纯化 一般实验室分离蛋白质采用100-200号筛目的的Sephadex G-200效果好， 脱盐用Sephadex G-25、G-50，用粗粒，短柱，流速快。 2) 脱盐/置换buffer 挑选标准蛋白质：cyt C(12500), Mb(16900), 胰凝乳蛋白(23200),卵白蛋白(45000)和Hb(64500)。 3) 分子量测定 条件：在凝胶介质分级范围内。 亲和色谱法（AC） 一般用于纯化蛋白质和核酸等大分子物质的方法的主要依据是各种大分子物质之间理化特性的差异性。 缺点： 由于这种差异性较小，因此要得到一种纯度稍高的物质，常常需要繁琐的操作，经历较长的时间，但最终收得率却甚低。 亲和色谱是利用生物大分子和固定相表面存在某种特异性亲和力，进行选择性分离的方法 它通常是在载体（无机或有机填料）表面连接上配体（酶、抗原或激素等）。这种固定化的配体将只能和特异性的生物大分