蛋白质组学-2013910.pptVIP

蛋白质组研究的必要性 迄今为止，蛋白质组学研究已形成了一套相对固定的策略，可分为三个主要过程： 第一是电泳前样品的预处理； 第二是双向凝胶电泳分离蛋白质，包括凝胶图谱的分析； 第三是蛋白质的鉴定及其性质和功能的研究。 （一）考马斯亮蓝染色 考马斯亮蓝染色是最常用的蛋白质染色方法。考马斯亮蓝R-250化学名为三苯基甲烷，R代表红蓝色。考马斯亮蓝R-250与蛋白质的碱性基团可逆结合，染色线性范围可达1～55μg，灵敏度为30～100ng蛋白质。考马斯亮蓝染色的最大优点是染色重复性好，操作简便，不影响后续的质谱鉴定，灵敏度比常用的氨基黑高100倍，但低于银染色和荧光染色，不能满足对低丰度蛋白质的检测要求，样品用量大。 （二）银染色 原理 在酸性硝酸银溶液中蛋白质与银离子发生作用，然后在碱性pH条件下，银离子被甲醛还原成银颗粒沉淀在蛋白质上而呈显棕黑色。银染色灵敏度很高，是考马斯亮蓝染色法的100倍，但操作繁琐，重复性不如考马斯亮蓝染色，对糖蛋白、钙结合蛋白的染色效果差。 (三) 荧光染料染色 荧光染料染色法是利用结合于蛋白质的荧光染料发出的荧光来检测蛋白质。用于蛋白质染色的荧光染料很多，有的共价结合于蛋白质上，有的和蛋白质形成非共价结合。目前商品化的荧光染料有SYPRO Ruby, 其染色方法操作简便，灵敏度高达1～10ng，染色线性范围宽，对糖蛋白、脂蛋白染色效果好，不影响后续的质谱鉴定，是一种较理想的蛋白质染色方法，但价格较昂贵。 一 、肽质量指纹图谱法 基本过程为：蛋白质混合物样品经过2-DE分离后，从胶上切下需要鉴定的蛋白质斑点，用胰蛋白酶进行水解，胰蛋白酶在特定位点切割蛋白质，形成长短不一的多肽混合物，用MALDI-TOF质谱仪对多肽混合物进行质量分析，得到肽片段质谱图，一个质谱峰代表一种肽片段离子。由于各种蛋白质的一级结构不同，胰酶水解后产生的肽片段数目及质量均不相同，具有特征性，因此将得到的肽片段质谱图称为PMF。下图为卵白蛋白PMF： 二 、肽序列标签鉴定法 蛋白质由20种氨基酸组，在蛋白质上随意选取一个四肽序列，根据概率论计算，另一个蛋白质上出现相同四肽序列的概率为1/204，即1/160,000，因此从理论上说，只要测定一个蛋白质中5~6个氨基酸残基的序列，就足以作为鉴别蛋白质的特异性标签，称为肽序列标签。 酵母双杂交技术基本概念 酵母双杂交技术(yeast two hybrid system)是20世纪90年代初期发展出来的一种用于研究蛋白质相互作用的方法手段，它利用酵母细胞内的真核表达系统，将两种外源蛋白质的基因分别与酵母转录因子的两个功能结构域融合，通过质粒导入酵母细胞，以酵母细胞表型的改变作为外源蛋白是否发生相互作用的筛选标志。 * * 2-DE 的缺点 难以有效分离极酸、极碱性蛋白质，极大、极小蛋白质，及低丰度蛋白质。 胶内酶解过程费时、费力，难以与质谱实现自动化联用。 新型非凝胶技术 液相色谱法（liquid chromatography, LC） 对在双向电泳中难以分离鉴定的高分子量、低分子量、极酸性、极碱性和疏水性强的蛋白进行有效的分离鉴定。 LC-MS/MS：液质联用技术 Cell culture Protein extraction 2-DE staining ? Image analysis Scanning 微量测序（microsequencing） N-末端 Edman 降解：经凝胶分离的蛋白质直接印迹在PVDF膜或玻璃纤维膜上 → N末端氨基酸残基经苯异硫氰酸酯修饰 → 从多肽链上切下修饰的残基 → 再经层析鉴定 → 余下的多肽链被回收再进行下一轮降解循环。 缺点：过程缓慢，消耗大，试剂昂贵。 质谱分析（Mass spectrometry） 基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）差异来分离并确定样品分子量。 Inlet Ionization Mass Analyzer Mass Sorting (filtering) Ion Detector Detection Ion Source ? Solid ? Liquid ? Vapor Detect ions Form ions (charged molecules) Sort Ions by Mass (m/z) 1330 1340 1350 100 75 50 25 0 Mass Spectrum 主要质谱类型 MALDI-TOF MS: 基质辅助激光解析吸附电离飞行时间质谱 (Matrix-assisted laser desorption/ionization time of fli