第七章酶的定向进化和稳定性探究.ppt

Enzyme Engineering酶工程 第七章 酶的定向进化与稳定性探究 第一节 定向进化简介 第二节 定向进化的应用 第三节 蛋白质的稳定性 第四节 蛋白质不可逆失活的原理和机理 第一节 定向进化简介 一．理论来源 二．概念 三．定向进化的选择策略 四．杂合酶 一．理论来源 利用基因工程原理可以在实验室中模拟生物进化过程 化学进化 生物进化 二．概念 酶分子改造 化学修饰，定点突变 定向进化 定向进化示意图 随机突变+定向选择＝目标突变体 定向进化 属于蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。 澄清一个事实：定向进化不是定点突变 定向进化：突变 筛选 突变位点是随机的，不确定的； 突变位点的数目也是不确定的； 突变的效应更是不可预知的； 理论上讲，凡是能够引起突变的因素（物理的，化学的， 生物的）都可以应用于定向进化中突变体的产生。 定点突变： 突变位点是确定的，突变的个数也是预知的； 突变的效应可能是已知的，也可能是未知的； 定点突变的方法一般是以PCR技术为基础的。 三．定向进化的选择策略 关键突变和筛选 突变——采用回交法 筛选蛋白酶选择平板初选，配合活性染色和X光片消化分析 成功实例 Lipase genes (lipB52, lipB68) isolated from Pseudomonas fluorescens B52、B68Genbank Accssion number AY623009、AY694785 成功实例 Lipase gene (lipB52）expressed in Pichia pastoris KM71 functional lipase secreted by Recombinants screened with BMMY plates Enantioselective esterification of R-phenylethanol, S-phenylethnol remained at its original form eep＞98.7% and conversion ＞48.1% at 40oC for 48 hours. Transesterification between soybean oil and methanol. Conversion ＞90% at 40oC for 35 hours Characterization of a psychrophilic lipase from Pseudomonas fluorescens strain B68 p-nitrophenyl caprate as substrate. Optimal temperature as 20?C ，50% activity at 0?C。 Chiral selectivity of lipB68 Production of Biodiesel via Transesterification Catalyzed by Lipase B68 Prodrugs of ibuprofen Synthesis of ibuprofen glucopyranside derivative Dongzhi Wei*, Ping Zou, J. Molecular Catalysis B: Enzymatic, 2002,18:273-278. 四．杂合酶 来自不同酶分子中的结构单元或是整个酶分子进行组合或交换，以产生具有所需性质的优化酶杂合体。 第一节结束 点击返回 第二节 定向进化的应用 一．提高酶分子的催化活力 二．提高酶分子的稳定性 三．提高底物的专一性和增加对新底物．催化活力的进化 五．对映体选择性的定向进化 六．变换催化反应专一性 一．提高酶分子的催化活力 L—天冬氨酸酶定向进化研究 进行4轮易错PCR，筛选了3000个菌落。 得到酶活力提高28倍的突变体，该酶的pH稳定性和热稳定性均优于天然酶 二．提高酶分子的稳定性 T4溶菌酶11个不同的单点突变株将Tm提高0.8-1.4℃. 8株大肠杆菌核酸酶HI单点突变中，7株Tm提高了0.7-4.2℃ 三．提高底物的专一性和增加对新底物催化活力的进化 Gulick分离到了一株谷胱苷肽转硫酶，对于癌症治疗中烷化剂的耐受力提高了9倍 Widersten利用噬菌体呈现技术来增加谷胱苷肽转移酶与亲电底物结合力，没有成功 四．对映体选择性的定向进化 S型选择性的转氨酶转化?-丁