已知基因的序列获取策略兼谈引物设计与序列分析.pptVIP

Primer Premier 5.0 引物设计 限制性内切酶位点分析 DNA基元(motif)查找 同源性分析 Genetool V 2.0 Oligo6.69 四、测序图比对、拼接与虚拟克隆(in silico cloning) 常用本地软件：Clone manager、Vector NTI、DNAstar和ds-Gene等 在线工具：BLAST等 常用序列拼接软件 DNAstar 的SeqMan模块 VectorNTI程序的Contig Express模块 Sequencher 开始→所有程序→DNAstar →SeqMan 新的拼接任务 添加序列 打开保存序列的文件夹 选择序列 导入 整理一下末端 用鼠标拖动手动更改末端 用鼠标点击更改序列方向和形式 选择载体 自动查找 拼接 看看结果 点开测序图 6种阅读框 选择的序列的位置 NCBI查询所选择的序列 保存结果 打印成PDF文件也是一个不错的选择 运行VNTI 程序Contig Express 程序窗口，可以设定参数，一般用默认值即可。 导入测序结果（文件扩展名ab1改成abi）相关软件 EditView for Macs ；Chroma for Windows] 也可以用鼠标右键 导入后可以双击查看和编辑各个测序结果 选择序列，根据实际情况调整序列末端 选择序列拼接 双击查看结果 输出结果到剪贴板，注意最上面的像机按钮，直观吧。 开始→所有程序 导入序列 选择序列 此界面调整参数 详细说明 拼接 双击查看结果 输出结果 已知基因序列的获取策略——兼谈引物设计与序列分析 黄 钢 第三军医大学遗传教研室 2006.11.1. 获取序列信息，设计合适的引物 选取相应的组织或细胞，提取RNA并RT PCR扩增获得全长cDNA 装入合适的克隆或表达载体，菌落PCR、酶切与测序证实 根据需要进一步进行亚克隆 RNase H消化（可选） 一、如何获取已知目的基因的序列信息 先查找其蛋白相关信息,了解该基因编码产物的基本情况与功能（） 进一步查找其核酸相关序列信息，常用数据库：Genebank、EBI、DDBJ 二、目的基因cDNA序列的获取方法 cDNA文库扫描 RT-PCR 人工合成 组织RNA的提取 在匀浆器中加工冷冻的组织 通过注射器加工冷冻的组织 在液氮中将组织研磨成粉末 在液氮中研磨组织至粉末状，细胞裂解更完全，产量比前二者多一倍。 合适的RNA提取方法加上合适的组织处理方法，才能够获得最佳的提取效果 RNA提取两要素 忌讳贪多：不能指望1ml Trizol 提取100mg以上组织，一般50mg用1mlTrizol较合适 速战速决：尽量缩短提取时间，不要完全照搬Protocol,比如匀浆后如果没有很多组织碎片的话，可以立即加入氯仿，立即离心，14000rpm离心10min,取完上清加入0.6~1体积的异丙醇，立即高速离心（14,000rpm,5min），..... 总之尽量快速！ 尽量减少RNAase污染 RNase的危害主要集中在将RNA pellet溶解在水中之后，防止RNA降解的重点应当放在组织样本的保存和RNA水溶液的保存上。 注意实验前的准备工作：各种器材的去RNAase处理与无RNAase的准备。 长期保存RNA时建议用去离子甲酰胺溶解总RNA沉淀 如何确认RNA的质量 RNA的电泳图谱 检测RNA溶液的吸光度 保温试验 荧光染色、毛细管电泳和Agilent2100生物分析仪分析 28S 18S 5S RT引物的选用 GSP：适合序列肯定的模板，常用于一步法RT－PCR。但是引物设计质量影响RT的结果。在扩增低丰度的转录本时是最好的。 Oligo dT引物:真核生物的mRNA适用，建议用于高质量RNA及全长转录本的逆转录； 随机引物：适合各种RNA的RT，可用于mRNA片段的逆转录。 RT中提高合成全长cDNA的效率 消除mRNA 二级结构：逆转录之前将RT引物与RNA 模板进行短暂的热变性, 可破坏mRNA 二级结构, 促进锚定引物与模板的正确配对。 选用RNase H灭活改造的新型耐高温逆转录酶： Thermoscript、Superscript Ⅲ等，RT后建议进行RNase H消化处理。 锚定RT引物的选用：5–(T)25V N–3‘ 热启动RT 有条件者选用Tricine-EDTA Buffer溶解cDNA 10 mM Tricine-KOH (pH 8.5) 1.0 mM EDTA 小于5微克 可自己找公司合成 建议用热盖PCR仪或空气浴孵箱保温 建议选用RNase H消化 高保真DNA 多聚酶的选用 常用高保真DNA 多聚酶：如Pfu、Deep Vent、Vent、Pwo、KOD、Pyrobe