常用工具酶学时.docVIP

上海交通大学医学院教案 教 案 课程名称_分子生物学_ 授课题目 基因重组 授课日期 2008年 11 月18、19、26日 授课班级 检验06级本科 授课时数 9学时 授课方式 理论课 授 课 重 点 、 难 点 重点： 基因重组的策略和过程 基因重组常用的工具酶 重组子的筛选和鉴定 难点： 重组子的筛选 载体的分类和特点 授 课 内 容 、 教 具 与 时 间 分 配 授课内容： 基因重组：体外根据人为意愿对DNA分子进行重组，构建成具有自主复制能力的重组DNA分子，再导入宿主细胞，然后对单个细胞开始进行大量扩增，最终获得大量同一的DNA分子。 第一部分 常用工具酶(3学时) 一、限制性内切酶：能够特异地识别双链DNA分子中特定序列并进行切割的核酸水解酶 1、 限制性内切酶的分类和特点：I型、II型和III型 其中II型是用于基因重组的限制性内切酶 II型限制性内切酶的作用特点：4-8个碱基的回文序列，可以产生粘性末端或平末端 2、命名 3、识别与切割：异源同工酶、同尾酶 4、酶单位活力和星号活性 二、DNA连接酶 催化双链DNA分子内或两个双链DAN分子间相互邻近的5`磷酸末端和3`羟基末端生成磷酸二酯键，从而封闭DNA双链中的切口或将两个DNA分子连接起来。 DNA连接酶的分类和作用 三、其他工具酶 DNA聚合酶（TaqDNA聚合酶、Klenow片段等）；T4多核苷酸激酶；末端转移酶；碱性磷酸酶 第__1___页 授 课 内 容 、 教 具 与 时 间 分 配 常用载体（1学时） 一、载体的概念和分类 载体（vector）:携带靶DNA分子片段进入宿主细胞进行扩增和表达的运载工具。可分为 克隆载体和表达载体 载体选择的条件：复制能力；外载片段；分子量；筛选标记；调控原件等 二、质粒载体 1、pBR322质粒载体 2、PUC质粒载体 三、噬菌体载体 1、λ噬菌体载体：λ噬菌体载体的组成、cos位点 生长方式（溶源性生长和溶菌性生长） 2、粘粒载体（cosmid） 3、单链丝状噬菌体载体 四、穿梭载体 1、SV40载体：原核系统构件、真核系统构件、RNA修饰信号和多克隆位点 2、反转录病毒载体 五、人工染色体 第三部分 目的基因获得（2学时） 目的基因获得的方法;PCR、DNA文库或cDNA文库、酶切等 第四部分 重组体的构建和转化（1学时） 重组体的构建 DAN和载体的连接：粘性末端连接、平端连接、同聚体加尾连接、人工接头连接 重组DNA分子导入宿主细胞 转化：重组DNA分子导入细菌，使其在细菌中扩增表达的过程为转化 CaCl2法：感受态细菌 电穿孔法 转染：外源DNA分子导入真核细胞的过程 磷酸钙共沉淀法 脂质体法 DEAE-葡聚糖介导转染 电穿孔法 显微注射法 第五部分 重组子的筛选和鉴定（2学时） 根据遗传学性状进行筛选 抗性标记筛选 抗性标记插入失活筛选 α互补筛选 标记补救筛选 根据重组DNA分子的生物学特性筛选 重组质粒的快速裂解和电泳鉴定 限制性内切酶图谱分析 PCR扩增技术 核酸分子杂交 小结 复习 思考 题参 考书 小结： 1基因重组的策略和过程 2基因重组常用的工具酶 3重组子的筛选和鉴定 复习思考题： 概念：DNA重组 限制性内切酶 DNA连接酶 星号活性 Klenow片段 DNA聚合酶 载体 转化 转染 简答题： DNA重组的基本策略 常用的DAN重组的工具酶 重组体的筛选和鉴定方法 CaCl2转化的基本原理 目的基因如何获得 参考书： 《分子生物学检验技术》 《分子生物学》 《医学分子生物学》 上课教师__刘湘帆__ 第__3__页