生物技术大实验101016.ppt

（一）实验目的 掌握回收DNA的方法 （二）实验原理 柱回收法是将树脂做成层析柱，吸附带负电的DNA分子，再用洗脱液将DNA从层析柱上洗脱下来，从而达到回收和纯化DNA的目的。 柱回收法操作简单，回收率高。 实验前准备 加入 8mL无水乙醇稀释 DNA Wash buffer, 并于室温保存。 试剂盒编号：D6492-00, D6493-00。 OMEGA E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit 实验步骤 1. 琼脂糖凝胶电泳分析PCR产物。 2. 测量PCR产物体积并将其转移至1.5mL离心管中，加入4-5倍体积的Buffer CP。 3. 漩涡混匀，短暂离心收集管盖上液滴。 4. 把HiBind DNA 柱子套在2mL收集管中。 5. 把PCR/CP 混合液转移至HiBind DNA柱子中，室温，10000 ×g 离心1min。 OMEGA E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit 6. 去除滤液，把柱子重新装回收集管中。若PCR/CP混匀液超过700μL, 每次转移700μL至HiBind DNA 柱子中，离心后重复5-6步至所有的混匀液都从柱子中过滤完。 7. 转移700μL DNA Wash buffer（已用乙醇稀释）至柱子中， 按上述条件离心。 注：使用前DNA Wash buffer 必须用无水乙醇稀释，并于室温保存。 8. 重复步骤7一次。 OMEGA E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit 9. 弃去滤液，把柱子重新装回收集管，12000g离心空柱2min以甩干柱子基质。 注意：不要忽略此步-这对从柱子上除去乙醇至关重要。 10. 把柱子装在一个干净的1.5mL离心管中，加入30 μL灭菌双蒸水到柱基质上，室温静置2min，10000g离心1min以洗脱DNA。 OMEGA E.Z.N.A. Cycle-Pure Kit 实验五 DNA连接与TA克隆 实验目的 学习掌握DNA连接和TA克隆的技术与方法 实验原理 连接：线性DNA以共价键连在一起的过程。 TA克隆：直接将PCR产物质粒载体的快速克隆方法。 PCR产物末端不依赖模板而加上一个腺苷酸（A），T载体的末端带有T。 载 体 ?? 载体是运送目的基因片段进入宿主细胞的工具，目前最常用的载体包括细菌质粒、λ噬菌体、cosmid质粒等。 ?? 质粒是细菌细胞中自然存在于染色体外可以自主复制的一段环状DNA分子。进入到宿主细胞中的一个质粒可以大量增加其拷贝数。 载体的结构 1.抗性基因（Antibiotic resistance gene,such as Ampicillin resistance gene, Kanamycine resistance gene) 2.启始复制子（ori, Origin of replication)； 3.多克隆位点(MSC, Multiple cloning site or polylinker)； 4.标记基因(Marker gene, such as LacZgene)。 蓝白斑筛选原理 蓝白斑筛选是重组子筛选的一种方法，是根据载体的遗传特征筛选重组子，如α-互补、抗生素基因等。带有β-半乳糖苷酶基因（lacZ）的调控序列和前146个氨基酸的编码信息。???? 在这个编码区中插入了一个多克隆位点（MCS），它并不破坏读框，但可使少数几个氨基酸插入到β-半乳糖苷酶的氨基端而不影响功能，这种载体适用于可编码β-半乳糖苷酶C端部分序列的宿主细胞，因此，宿主和质粒编码的片段虽都没有酶活性，但它们同时存在时，可形成具有酶学活性的蛋白质。? 这样，lacZ基因在缺少近操纵基因区段的宿主细胞与带有完整近操纵基因区段的质粒之间实现了互补，称为α-互补。??? 由α-互补而产生的LacZ 细菌在诱导剂IPTG的作用下，在生色底物X-Gal存在时产生蓝色菌落，因而易于识别，然而，当外源DNA插入到质粒的多克隆位点后，导致无α-互补能力的氨基端片段，使得带有重组质粒的细菌形成白色菌落。这种重组子的筛选，又称为蓝白斑筛选， 转化菌平板37℃温箱倒置培养12-16hr后，有重组质粒的细菌形成白色菌落。 T1（F‐ φ80(lacZ)ΔM15 ΔlacX74hsdR(rK‐mK+) ΔrecA1398 endA1 tonA）为常规基因克隆中普遍使用的菌株，倍增时间大约为50分钟，是当前生长速度最快的大肠杆菌细胞。在氨苄抗生素平板上，8-9小时可见抗性克隆。该菌还可以与表达β半乳糖苷酶α肽的质粒在IPTG 和X‐gal存在下实现α互补，用于蓝白斑筛选。 连接反应 在微型离心管中依次加入溶液：