生物大实验教案.docVIP

试验一 一 试验目的：理解并掌握动物基因组DNA提取的原理及步骤理解、掌握目的DNA纯化技术二 试验原理：利用EDTA和SDS裂解细胞，通过P.K酶的消化作用，释放总DNA，并用酚、三混、二混抽提以获得DNA利用不同分子量DNA在琼脂糖凝胶电泳中迁移率的不同，将不同分子量的DNA片段分开 三 主要仪器、试剂： （一） 仪器 ：台式高速离心机，恒温水浴锅紫外透射仪、凝胶电泳系统、Tris、冰乙酸、EDTA、琼脂糖、双指示剂、纯化试剂盒、PCR产物 （二） 试剂：Tris, SDS, EDTA, P.K酶, RNAase, TE缓冲液, 酚，三混（酚25：氯仿24：异戊醇1），二混（氯仿24：异戊醇1） 四 试验步骤：1．取组织0.5g于瓷板上吸水纸吸干，尽量剪碎，分装于EP管中。 2．加TE 500ul，加10％SDS至终浓度1％。 3．以上混匀，加P.K酶至终浓度200ug/ml。 4．打匀后于50℃水浴4－5小时，每20-30分钟轻摇一次。 5．加等体积酚倒装混匀10-15分钟后用酚配平，离心：9000r、10分钟，取上清重复一次。 6．取上清，加等体积三混，混匀5－10分钟，离心：9000r、10分钟； 取上清，加等体积二混混匀5－10分钟，离心：9000r、10分钟。 7．取上清，加2.5倍体积冰冻无水乙醇，沉淀DNA，可见絮状沉淀。 8．取出絮状沉淀，70％乙醇洗涤，真空抽干或风干。 9．加TE缓冲液溶解DNA。目的DNA的纯化准备：、 TAE 配制：Tris 4.84g 冰乙酸 1.14ml 0.5M EDTA1ml----定容1000ml 、灭菌：（1）TAE、手术刀、镊子、制胶用锥形瓶、称量纸、双指示剂、量筒等高温高压灭菌。 （2）一次性手套、电泳槽、内槽、梳子等先用蒸馏水洗净，再用灭菌的TAE洗净，在紫外线下照射40分钟。 制胶：配制0.8％琼脂糖凝胶（TAE） 加样：样品＋双指示剂（1/4体积）于0.5EP中混匀、加样。 电泳：100V 电压 40-60分钟 切胶收集：用一次性手套垫住于紫外线下切下所需DNA装入纯化柱；按照纯化试剂盒要求操作。 检测：于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测目的DNA五 结果分析： 试验 目的基因的 PCR扩增 一 试验目的：理解并掌握PCR扩增技术 二 试验原理：利用DNA天然复制过程，将待扩增DNA片段进行体外扩增，通过变性、退火、延伸 三个步骤，理论上单拷贝经过N个循环可获得2N个拷贝。 三 仪器与试剂： PCR扩增仪；凝胶电泳系统；0.2EP管等 DNA模板；buffer;Mg2+;Dntp;上、下游引物，Taq酶；矿物油 四 试验步骤： 1.在0.2EP管中按照下列反应体系(25ul)： buffer Mg2+ dDTP DNA模板 引物1 引物2 ddH2O Taq酶+ ddH2O (ul) 2.5 2.5 2.0 1.0 0.3 0.3 13.2 0.3 + 2.7 混匀，加15ul矿物油，瞬时离心 2. 97℃预变性7分钟，加Taq酶，瞬时离心。按照下列步骤扩增：94℃ 40秒；52℃ 40秒；72℃ 60秒；35个循环；72℃延伸10分钟；结束或4℃保存。 3.扩增产物检测：取5ul产物于1.5％琼脂糖凝胶电泳检测。 五 结果分析： 一 试验目的：理解并掌握外源DNA与质粒的连接以及质粒转化的技术方法 二 试验原理：利用连接酶将外源DNA连接到质粒载体上，并将此质粒载体转化到感受态细胞中 三 主要仪器、试剂： 恒温水浴锅 AMP（氨卞）；IPTG；X－gal；TA载体试剂盒；已纯化的PCR产物 四 试验步骤：（）DNA连接反应 在0.2EP管中进行连接，总体积10ul，常温连接1小时 TATA载体 0.5 Ligase solution I 4.5 PCR产物 5.0 （）转化 1. 将感受态细胞置于冰上，轻轻将细胞悬浮 2. 取150ul感受态细胞加入10ul连接液混匀，冰浴30分钟 3. 42℃热休克90秒，冰浴2分钟 4.加无AMP的LB培养基300ul，37℃水浴1小时 5.倒二板含有AMP固体琼脂平板，每板均匀涂上40ulX－gal 和4ul IPTG的混合液，停1-2分钟待略干后加转化液每板105ul 6.室温平放20分钟，倒置37℃培养12小时，观察 五 结果分析 试验 感受态细胞的制备 一 试验目的：理解并掌握感受态细胞制备的技术 二 试验原理：利用预冷的CaCl2液改变DH5a菌的细胞的通透性，便于质粒的转化。 三 主要仪器、试剂： 分光光度计；恒温振荡培养箱；冷冻离心机