[医学]细胞毒实验.ppt

补体依赖的细胞毒实验 血红蛋白酶释放法（HbE-Assay） 同位素释放法： 51Cr、125I-UdR 、3H-TdR　等　 乳酸脱氢酶释放法 MTT比色法 测定法 Excel 作 图 LAK的临床应用　1984年11月Rosenberg研究组经美国食品和药品检验局（Us Food and Drug Administration,FDA）批准下，首次应用IL-2与LAK协同治疗25例肾细胞癌、黑素瘤、肺癌、结肠癌等肿瘤患者。治疗用LAK细胞数量在0.6-18.4*1010，IL-2用量2.8*105-3.32*106U/kg。其中11例肿瘤缩小超过50%，1例黑素瘤完全消退。1988年该研究组总结了IL-2与LAK细胞协同治疗222例肿瘤患者，其中16便患者肿瘤转移灶完全消退，26例患者肿瘤消退50%以上，该疗法对转移性肾细胞癌、黑素瘤、结肠癌和非何杰金氏淋巴瘤患者的疗效较显著。有报道乳腺癌、膀胱癌局部应用IL-2进行治疗也获得明显疗效。 　　 由于IL-2用量大，在治疗过程中可出现毒副反应，最常见和最严重的毒副作用是出现毛细血管渗漏综合征（capillary leak syndrome,CLS），主要表现为全身性水肿和多器官功能失调，可引起胸腹腔积液、肺间质水肿和充血性心力衰竭。引地卢CLS的机理可能与内皮细胞损伤和产生血管活性物质有关。 检测方法 ? 1.1.1? alamarBlue一步荧光测定法???? alamarBlue为活细胞代谢指示剂，易溶于水，进入细胞后经线粒体酶促还原产生荧光及颜色变化，可用以定量。本法与51Cr释放法纺织厂较有以下特点：①特异性相当但灵敏度更高，重复性好，组内及组间差异很小。②使用方便，无需预先标记靶细胞及离心和洗涤步骤，适用于大批量样品的高准确性自动测定。③alamarBlue的使用浓度不影响细胞正常代谢及基因表达，可在无菌条件下测定后继续培养扩增细胞，有利于对培养细胞的连续监测及深入研究。④还可测定淋巴细胞增殖或化学物质的细胞毒性及细胞凋亡。⑤多种粘附或非粘附细胞系、细菌、真菌等可用作靶细胞，所需效应细胞数较少（3×105/孔即可）。⑥含胎牛血清（FCS）及酚红的培养液也不干扰测定结果 1.1.2? Calcein-AM荧光扫描测定法??? Calcein acetoxymethy1酯（Calcein-AM）是一种胞浆荧光标记物，本身无荧光，渗入细胞后细胞内酯酶催化生成的水溶性绿色荧光物质不易透出细胞。靶细胞用其标记后与效应细胞共充，再加Fluoro-Quench试剂（一种以Ca2+螯合的小牛血红蛋白主要成分、还含溴化乙啶试剂，它对细胞无毒，不能进入活细胞但可能进入膜已破损的死细胞），淬灭培养液中的荧光，在板式荧光扫描仪上定量测定活细胞内的荧光强度，与靶细胞对照孔（代表细胞100%存活）比较。即可计算效应细胞杀伤靶细胞%。本法简便可靠，无南收集和转移培养上清，重复性高，变异性小，测定数据自动输入计算机，适于大批量测定；可测CTL、LAK及NK细胞活性，还可在光学显微镜或荧光显微镜下直接观察细胞。不足的是对某些高核浆比的细胞染色效果不太好；Calce-in-AM在高浓度时可能损害细胞功能。 1.2.1? PE-mAb/FITC-annexin V 荧光标记法????? 正常细胞的磷酯酰丝氨（PS）位于细胞膜内表面，细胞凋亡时翻转露于膜外侧，可与annexinV高亲合力结合。研究发现PS外翻为细胞凋亡的早期事件，先于膜通透性增加所致51Cr或其他染料的释放。将效应细胞与靶细胞充分共育后，用PE结合的效应细胞特异性单克隆抗体（如CD8-PE）标记效应细胞（不能与PE-mABA结合的细胞即为靶细胞），再用FITC-annexin V标记凋亡靶细胞，用流式细胞仪区分并定量此三类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。本法①简单快捷，无需预标记，直接将上二试剂加入测定管即可；②与51Cr法相关性好（r=0.989），在早期时段更为灵敏，还可在进行分析，尤其适用于动力学分析；③可允许效应细胞与靶细胞长时间共育，对探讨E通过合成及分泌某些细胞因子（如TNF）而杀伤靶细胞的机理性研究特别有利；④可用荧光显微镜观察测定。 不能被PE-mAb 标记的为靶细胞 未死亡靶细胞 FITC-annexin V 标记凋亡靶细胞 PE-mAb标 记效应细胞 用流式细胞仪区分并定量此三类不同的细胞群，即可计算出效应细胞杀伤靶细胞%。 1.2.2? DIOC18/碘化丙锭（PI）荧光标记法???? 用DIOC18标记靶细胞膜，用红色荧光核染料PI标记效应细胞和死亡靶细胞，通过流式细胞分析可清楚区分2类细胞。在用人和猪的外周血单核细胞（PBMC）作效应细胞时可观察到靶细胞溶解%与不同效应细