[工学]第9章 DNA序列分析.ppt

西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 五、序列多重比对 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 六、引物设计 西南大学生物技术专业 基因工程 * 七、BLAST (Basic Local Alignment Search Tool): Genbank同源性搜索 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 八、DNA和蛋白结构预测 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * 西南大学生物技术专业 基因工程 * * * * /department/criminal_investigation/products/dna/（来源） 第九章 DNA序列分析 第一节 Maxam-Gilbert化学降解法 第二节 Sanger链终止法 第三节 DNA片段序列测定的策略 第四节 核苷酸序列的生物信息分析 第一节 Maxam-Gilbert化学降解法 化学降解法：人们用专一性作用于A、T、G、C碱基的化学药剂分别处理经内切酶切割而成的一定长度DNA片段，通过控制反应时间，既可获得分别以A、T、G、C为结尾的四组由所有可能长度核苷酸片段组成的DNA片段群。 除了要研究与DNA的高级结构、DNA-蛋白质结构相关性采用化学降解法外，对于单纯以测序为目的的实验，普遍采用后面所讲的酶促合成法。 第二节 Sanger链终止法 1977年Sanger设计了一种通过DNA复制来识别4种碱基的方法，进行DNA序列测定，即双脱氧链终止法。 Sanger法获得诺贝尔化学奖。 一、Sanger双脱氧链终止法原理 在模板指导下，DNA聚合酶不断将dNTP加到引物的3’-OH末端，使引物延长，合成出新的互补的DNA链，如果加入双脱氧三磷酸核苷(ddNTP)，由于双脱氧核糖的3’位置上缺少一个羟基，故不能同后续的dNTP形成磷酸二酯键，即形成一种全部具有相同5’-引物端和以ddNMP残基为3’端结尾的一系列长短不一片段的混合物。由于双脱氧核苷酸在每个DNA分子中掺入的位置不同，采用聚丙烯酰胺凝胶电泳区分长度差一个核苷酸的单链DNA，从而读取DNA核苷酸序列。 二、双脱氧终止法测序反应体系： DNA聚合酶 单链DNA模板 带有3-OH末端的单链寡核苷酸引物 Mg2+ 4种dNTP (aATP、dGTP、dCTP和dTTP) 4种ddNTP (ddATP、ddGTP、ddCTP和ddTTP) Sanger法DNA测序的试剂 ① 引物：通常由20-23个碱基构成，G+C=12，A+T=8到11，Tm=60-68℃，避免形成引物二聚体或形成发卡样结构 ② 模板 ③ DNA聚合酶 ④ 2’,3’-双脱氧核苷三磷酸 （2’,3’-dideoxynucleoside triphosphate, ddNTP） ⑤ dNTP 三、测序反应的种类 ① 引物标记法(Dye primer reactions) ② 终止物标记法(Dye terminator reactions) This figure shows the structure of a dideoxynucleotide (notice the H atom attached to the 3 carbon). Also depicted in this figure are the ingredients for a Sanger reaction. Notice the different lengths of labeled strands produced in this reaction. This figure is a representation of an acrylamide sequencing gel. Notice that the sequence of the strand of DNA complementary to the sequenced strand is 5 to 3 ACGCCCGAGTAGCCCAGATT while the sequence of the sequenced strand, 5 to 3, is AATCTGGGCTACTCGGGCGT 测序过程: 1. 模板与引物杂交 2. 引物的延长和合成阻断 四个试管分别加入：DNA聚合酶、dNTPs、标记引物 终止剂不同：ddA、ddG、ddC、ddT 四个试管中所有产物是一系列长度只差一个核苷酸的聚合链 3. 电