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花生过敏原 花生又名落花生，原产于南美洲一带，世界上栽培花生的国家有100多个，亚洲最为普遍。 花生含有很多重要的营养物质，如：维生素Ｅ、烟酸、叶酸、钙、磷、镁、锌和铁以及丰富的蛋白质。 花生被人们誉为“植物肉”，含油量高达50%，品质优良，气味清香。除供食 用外，还用于印染、造纸工业， 花生也是一味中药。 花生的过敏反应 过敏性疾病被世界卫生组织列为 21 世纪重点防治的三大疾病之一。 美国报道的 63 例食物过敏引起的死亡患者有 59 ％是由花生过敏原引起的，占第一位。我国也有报道花生导致过敏性休克和过敏性死亡的病例。 在亚洲一些国家和地区, 花生食品是引起食物过敏的主要过敏原之一, 其主要过敏人群是儿童, 通常会产生严重的变态反应, 有时会引起休克并危及生命。 花生过敏反应是人体对花生过敏原产生的由IgE介导的Ｉ型超敏反应。 出现快，消退也快；一般不易造成组织细胞的损伤，多表现为功能紊乱。 摄入含量甚微的花生过敏原食物就可能对高度敏感的患者引发过敏反应, 如肠胃不适、过敏性皮炎等疾病, 严重的甚至会发生过敏性休克和过敏性死亡。 据统计在2009年，世界上大约有3400万t的花生制品。 近年来美国及欧盟等国家食品标签法中规定必须把花生作为主要过敏原成分加以标示并开始对部分进口食品进行花生过敏原检测，而中国食品出口企业常因食品过敏原标注不正确而被美国 FDA 通报且遭遇退货。 脱敏治疗 目前，对花生过敏患者的治疗仍无有效的方法。 对花生变应原过敏的患者避免食入含有花生的食物是目前最有效的预防方法之一。 WHO指出变应原特异性免疫治疗（脱敏治疗）是除避免接触变应原外唯一能够影响变态反应性疾病自然进程的治疗手段。 但是传统的免疫脱敏治疗大多使用变应原粗提物，因而包含很多缺点，例如副作用大、提取物量小、纯度低等等。 花生过敏原 截至 2010 年国际免疫联合会过敏原命名小 组委员会(IUIS)已经确认了花生中的11种过敏原蛋白。其中Ara h 1、Ara h 2、Ara h 3/4、Ara h 6 属于主要过敏原，可被90% 花生过敏患者识别。 花生过敏原的检测 目前, 关于食品中过敏原的定量检测, 主要采用双免疫扩散试验、放射免疫法和高效液相法、聚合酶链式反应( PCR) 分析法、组胺释放实验( HRT ) 、过敏原指纹图谱快速检测方法等。 而酶联免疫吸附分析( ELISA) 法具有操作简单、快速、处理样品量大、灵敏度高且廉价等优点。 酶联免疫吸附分析法 抗体的制备 纯化的花生抗原→对大白兔进行免疫→动脉 放血→抗血清 抗体纯化 血清于离心管中→加磷酸盐缓冲溶液+饱和硫 酸铵→离心→弃上清→溶解沉淀, 再逐滴加饱 和硫酸铵→静置 1 h →同样操作→对磷酸盐 缓冲溶液透析数次, 直至用萘氏试剂检测透析 液无黄色为止。 ELISA 方法的确立 抗体效价的确定 以阴性血清的吸光值为标准, 吸光值大于或等于该值的 2.1倍所对应的抗血清的稀释度即为该血清效价, 分别选择效价最高的抗体进行下一步实验。 半数抑制浓度Ic50的确定 取酶标板, 以 0. 1 g/ mL 透析过后的抗原稀释液进行包 被, 4 ℃保存过夜, 洗涤 3 次; 以 3% BSA-PBS 溶液封 闭, 37 ℃ 孵育 2 h, 洗涤 3 次; 分别加入 0、0. 01、0. 1、 0. 5、1、2. 5、5、10、20、50、100 ng/ m L 的标准 品, 再加入最佳浓度的稀释抗体, 37 ℃ 孵育 1 h, 洗涤 3 次; 加1:6000稀释的酶标二抗, 37 ℃孵育 0.5 h, 洗涤三 次; 加显色液, 37 ℃ 孵育 15 min 后加入终止液, 于酶 标仪上测定 450nm波长处的吸光度( A450) 。以 A / A0 为纵坐标, 以 100 倍的标准溶液浓度的对数值为横坐标 作图, 即得花生竞争标准曲线, 并制定标准曲线方程。 以 A/ A0= 0. 5时, 计算半数抑制浓度Ic50。 特异性测定 用纯化后不同浓度的花生蛋白替代花生过敏 原；按照竞争 ELISA 进行测定, 分别得到各 自的抑制浓度 Ic50，用公式计算交叉反应率。 根据交叉反应率的大小反映抗血清的特异性。 以 A/ A0为纵坐标, 以100倍的标准溶液浓度的 对数值为横坐标作图, 得到竞争标准曲线, 花生 抗原浓度在 0.01~ 30 ng/ mL 范围内具有较好 的线性关系, 其标准曲线为: y = - 0.1212x +0.9285( r =0.9819) , 经其计算得花生的Ic50 为 34. 28 ng/ mL , 检出限为 0.1ng/mL。 根据所建立的标准曲线及得到的线性回归方 程，可对花生制品过敏原蛋白的质量