载体构建试验报告单四试验操作.pdfVIP

验报告 体构建实验报告单 订单号： 一：背景资料 X 基因，提取RNA 并逆转录cDNA，PCR 出其cDNA，将其重组于pcdna3.1- (-)-C-3xflag 载体上。 二：要求服务内容 PCR，引物设计合成及载体构建，测序 三：实验材料和仪器 1. 主要实验仪器 PCR 仪：TC-3000 2. 主要实验试剂 EcoRI，NotI ，SalI，T4 D NA 连接酶：takara PCR 试剂盒，胶回收试剂盒： Omega 四：实验操作 1. 基因序列分析 对您的基因序列分析结果，均可以用 EcoRI 、NotI 、SalI 进行酶切，选择 pcdna3.1-(-)-C-3xflag 作为克隆表达载体，其结构图普如下 根据以上信息设计10 对引物： X 一次PCR 的F 引物：5 ‘CTG TGA AGA ACC GAG CCC 3 X 一次PCR 的R 引物：5 CTA GAG CCT GGT GAC ATCCC3 X n 端标签PCR 的F 引物: 5 ‘ATAT GCGGCCGC GGG ACC TGC AGGA AGC X n 端标签PCR 的R 引物: 5 ‘AATT GTC GAC CTA GAG CCTGG TGA CAT CC X C 端标签PCR 的F 引物: 5 ‘ATAT GCGGCCGC ATG GGA CCT GCA GGAAGC X C 端标签PCR 的R 引物: 5 ‘AATT GAA TTC GAG CCT GGT GAC ATC CCT 地址：广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3 号广州国际企业孵化器 电话：86-20 邮编：510663 传真：86-20 网址： Email：omegainfo@ 验报告 2. 各片断的PCR 根据各片断的特征及引物的GC 含量和计算出来的退火温度，设计PCR 程序 最终各片断的跑琼脂糖胶检测如图1： M2000 3. 片断的纯化 对PCR 所得各片断进行纯化，由于做PCR 过程中，尽管进行了退火温度的优化，但最后还是有拖尾 及杂带出现，因此 择凝胶回收纯化，纯化完再次进行凝胶检测。 4. 目的载体的获得 对含有pcdna3.1-(-)-C-3xflag 的菌液进行摇菌，抽质粒，检测质粒，如图2： pcdna3.1-(-)-C-3xflag pcmv-3xflag-N 5. 酶切 酶切用的是 EcoRI 、NotI 和 Sal I 、、NotI 分别进行对获得的目的片断和载体进行双酶切，由于 NotI 的特殊性（takara），开始同时酶切，载体没有切动，后来，先用EcoRI 切1.5 个小时后，再加NotI 切， 方切动。反应体系如下表 地址：广州高新技术产业开发区广州科学城掬泉路3 号广州国际企业孵化器 电话：86-20 邮编：510663 传真：86-20 网址： Email：omegainfo@ 验报告 所插入的基因简称 pcdna3.1- X-N X-N X-C X-C