L-天冬酰胺酶制备工艺研究概况.ppt

L-天冬酰胺酶制备工艺研究概况 班级：制药101 姓名:黄云云 学号:20100934122 L-天冬酰胺酶的基本介绍 1922年Clement发现豚鼠血清中存在天冬酰胺酶；1953年Kidd发现豚鼠血清中有抑癌作用的物质，其活性成分是蛋白质；1961年Broome确定了其有效成分是天冬酰胺酶，后来，Mash burn等报告指出从大肠杆菌中分离出天冬酰胺酶，具有同样抗癌活性。 天冬酰胺酶的基本性质 天冬酰胺酶呈白色粉末状，微有湿性，溶于水，不溶于丙酮、氯仿、乙醚和甲醇，水溶液20℃储存7d，5℃储存14d均不减少酶的活力。干品50℃ 15min酶活力降低30％，60℃ 1h内失活，最适PH8.5，最适温度37℃。 L-天冬酰胺的制备工艺 溶氧对L-天冬酰胺酶发酵的影响及其控制  溶氧对大肠肝菌L-天冬酰胺酶的合成有严重影响 通过装液量试验、接种量试验、葡萄糖试验和氧载体试验考察摇瓶发酵过程中溶氧对L-天冬酰胺酶合成的影响,通过通纯氧自控pH的发酵工艺进行溶氧控制和pH控制.结果:采用通纯氧自控pH的发酵工艺,可延长发酵周期,有效地防止菌体的过早自溶,大大促进L-天冬酰胺酶的合成,较分批发酵提高产酶83％,达到110u/mL. L-天冬酰胺酶的纯化与修饰 L-天冬酰胺酶的纯化 将L-ASP与高效先导序列pelB融合使得L-ASP在细胞外表达，并L-ASP在的N末端添加了6个组氨酸序列标签，然后采用亲和层析法分离纯化得到L-ASP ，成本高，并不适合大规模的工业化生产。 经蔗糖破壁，硫酸铵分级沉淀、透析、DEAEDE52、QSepharose Fast Flow等步骤纯化得到的比活力高，SDS检测时显示为一条带，RT-HPLC分析纯度达99%，最终回收率为50.5%，适合大规模的工业化生产。 L-天冬酰胺酶的纯化与修饰 L-天冬酰胺酶的修饰 L-ASP聚乙二醇化不但降级了胰蛋白酶对它的降解作用，而且修饰酶的抗原性与天然酶相比也大为下降。 此外，聚乙二醇化L-ASP与传统的脂质体化L-ASP相比有明显的优势。 L-天冬酰胺酶的纯化与修饰 微囊化修饰 将L-天冬酰胺酶用半透膜性质的聚合物制成微囊性固定化酶，其大小一般为1~500mm. 低分子底物可以自由出入胶囊膜，与酶接触而起反应，反应产物则因浓度不断增加而不断渗透出胶囊外面。 微囊性固定化可以克服天然酶针剂出现的抗体抗原反应。 该酶注射到人体后，对膜具有良好通透性的低分子底物，能长时间发挥作用，比天然酶的疗效好，而且急性毒副反应低。 L-天冬酰胺酶的纯化与修饰 用固定化酶反应器进行体外净化血液中L-天冬酰胺 方法： 经固定化L-天冬酰胺酶装填于柱中或将其固定在酶板、酶管或血液透析膜上，使得血液从固定酶上通过，除去癌细胞生长所需的L-天冬酰胺，从而达到治疗的目的。 改进的功能： 由于酶不与体内器官直接接触，也就不会发生毒性和过敏反应。并且具有天然酶的高度专一性和温和条件下高效催化的特点，还具有一定的机械强度；酶经固定化后，稳定性有较大的提高，还可以反复使用也可储存较长时间。 L-天冬酰胺酶 （9015-68-3）的注意事项 L-天冬酰胺酶在医药上的应用 对治疗白血病有显著疗效的L-天冬酰胺酶是第一种治疗癌症的酶。 当L-天冬酰胺酶注射进入人体后，人体正常细胞内由于有天冬酰胺合成酶，可以合成L-天冬酰胺而使蛋白质合成不受影响。而对于缺乏天冬酰胺合成酶的癌细胞来说，本身不能合成L-天冬酰胺，外来天冬酰胺又被L-天冬酰胺酶分解，因此蛋白质合成受阻，从而导致癌细胞死亡。 使用L-天冬酰胺酶时，可能出现过敏反应，偶尔还可以发生过敏性休克，但停药后，这些副作用会消失。因此，在应用这种酶之前，应做皮试。在一般情况下，注射该酶出现的过敏性反应包括发热、恶心、呕吐、体重下降等。对比起可怕的白血病来，这些副作用是轻微的痛苦，在没有找到更好的治疗方法之前是可以接受的。 另外芦笋内富含较多的L-天冬酰胺酶 国内L-天冬酰胺酶的研究进展 L-天冬酰胺酶的研究方向 1寻求具有生物相容性、容易为生物体降解，并经得起一定PH和温度改变，有一定亲水性和机械强度的固定化载体； 2通过进行底物保护、蛋白质保护或进行酶修饰等方法提高固定化酶活性。 3对固定化酶反应器的动力学研究。 4联合应用固定化酶反应器和血浆分离器同步处理生物体血液，净化后的血浆再与血细胞混合为净化后的全血； 5提高固定化酶反应器的灭菌及存储