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蛋白质免疫印迹技术及 常见问题分析 Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析 Western Blot基本原理 在电场的作用下将电泳分离的多肽从凝胶转移至一种 固相支持体，然后用这种多肽的特异抗体来检测。 Western Blot应用 目的蛋白的表达特性分析 目的蛋白与其它蛋白的互作 目的蛋白的组织定位 目的蛋白的表达量分析 Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析 Western Blot 流程 通过有机溶剂或水溶法制备总蛋白 水溶液提取法 针对水、稀盐、稀酸或碱溶液中的蛋白质。稀盐和缓冲系统 的水溶液对蛋白质稳定性好、溶解度大、是提取蛋白质最常用的溶剂 。 有机溶剂提取法 对于分子中非极性侧链较多的蛋白质可用有机溶剂提取，包括 乙醇、丙酮和丁醇等。 通过层析或电洗脱法制备目的蛋白 不连续的电泳缓冲体系。 SDS—蛋白质复合物在凝胶电泳时，不再 受蛋白质电荷与形状的影响，而只取决于 蛋白质分子量的大小。 凝胶成分 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 ?? SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 Tris-甘氨酸电泳缓冲液 凝胶浓度与蛋白分离范围 半干法 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲液湿润滤纸之间，电转10－30min。 湿法 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间，浸泡在转移装置的缓冲液中，电转45min或过夜。 转膜后检测 丽春红S染色 蛋白带出现后，于室温用去离子水漂洗硝酸纤维素滤膜，换水几次。 印度墨汁染色 只用于放射性标记抗体或放射性标记A蛋白探针的Western印迹过程。 封闭 脱脂奶粉 BSA Western Blot 膜封闭液（生物试剂公司提供） 把硝酸纤维素滤膜放在密闭塑料袋或者培养皿中，根据滤膜面积以0.1ml/cm2的量加入，摇床上平缓摇动，于室温温育1-2小时。倒掉缓冲液，立即加入一抗溶液与滤膜温育。 一抗用量也根据0.1ml/cm2来计算，室温1-2小时。倒掉一抗溶液，用250ml PBS漂洗液滤膜3次，每次10min。 加入用封闭液配制的二抗，摇床上缓慢摇动，室温温育1-2小时。 化学发光显色法 Western Blot简介 Western Blot一般流程 Western Blot常见问题分析 分子量Marker：确定蛋白条带的分子量 已知量标准产物的正对照 空白载体对照：如果是表达蛋白需要做表达前的 内参：看家基因编码表达的蛋白 谢谢大家！ TIANGEN BIOTECH CO., LTD. 一抗不是唯一特异的 二抗出现非特异结合 原因 对 策 制备单克隆抗体或者重新选取合成抗原多肽的位点 设立不加一抗，只加二抗的平行对照来检测二抗是否有非特异结合 出现非特异带 参照体系 底物显色液 HRP底物显色液 HRP-DAB底物显色试剂盒 增强型HRP-DAB底物显色试剂盒 沉淀型单组分TMB底物溶液 可溶型单组分TMB底物溶液 Pro-light HRP 化学发光检测试剂 AP底物显色试剂 BCIP/NBT底物显色试剂盒 Western Blot 800免费电话：800-810-2177 * 800免费电话：800-810-2177 TIANGEN BIOTECH CO., LTD. 关于免疫检测 利用抗原抗体反应来测定标本中抗原或抗体的方法称为免疫测定(immunoassay) 检测对象：具体免疫活性的物质 细胞免疫检验：免疫活性细胞及其功能的检测 体液免疫检测：抗原、抗体、补体的检测 反应特性：高度的特异性和敏感性 抗原抗体反应 可逆性：Ag＋Ab Ag.Ab 合适比例： 特异性：抗原决定簇和抗原结合位点 Western blot原理 蛋白样品的制备 SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳 转膜 封闭 一抗杂交 二抗杂交 底物显色 蛋白样品的制备 蛋白样品的定量 Bradford法 考马斯亮蓝G-250有红、蓝两种不同颜色的形式，在一定浓度的乙醇和酸性条件下，可配成淡红色的溶液，与蛋白结合后形成蓝色化合物，该化合物在595nm处有最大吸收值，化合物颜色深浅与蛋白的浓度高低成正比 。 TIANGEN产品 Br