[生物学]分子生物学.ppt

3. 分子克隆载体 载体的概念： 1.要把一个有用的基因（目的基因——研究或应用基因）通过基因工程手段送到生物细胞（受体细胞），需要运载工具（交通工具）携带外源基因进入受体细胞，这种运载工具就叫做载体（vector）。 2.将外源DNA 或基因携带入宿主细胞（host cell）的工具称为vector。 3.基因工程所用的vector实际上是DNA分子，常用的克隆载体：质粒、噬菌体和病毒。 载体具备的特点 1、 至少有一个复制起点，因而至少可在一种生物体中自主复制。 2、?具备合适的酶切位点，以供外源DNA插入。 3、?至少应有一个遗传标记基因，以指示载体或重组DNA分子是否进入宿主细胞。 4、具有较小的分子量和较高的拷贝数。 ?注：前三个特点必不可少。 说明： 1.穿梭载体（sbuttle vector） 指在两种宿主生物体内复制的载体分子，因而可以运载目的基因（穿梭往返两种生物之间，如：YEP,DIDB219 2.YAC Yeast Artificial Chromsome 由酵母基因和PBR322质粒衍生物构成，对克隆大的真核基因十分有用，在HGP中发挥主要作用。 3.BAC 细菌人工染色体。 3.1 质粒载体 1. 质粒的基本特性； 2. 标记基因； 3. 质粒载体种类； 1. 质粒的基本特性 1、质粒(plasmid)是细菌染色体外能够自主复制的环形双链的DNA分子。 2、质粒的类型： F质粒（性质粒、或F因子）：携带有帮助其自身从一个细胞转入另一个细胞的信息。 R质粒（抗性质粒）：带有一种或数种抗生素抗性基因，使寄主获得同样的抗生素抗性性状（resistance）。 降解质粒：携带有参与或控制一些代谢途径的基因。 4、质粒DNA不仅能在细菌中复制，并且在添加真核复制信号和启动子后，可以构建出能在原核和真核细胞中均可复制的穿梭质粒，并在真核细胞中表达，因此这类载体在基因工程中应用广泛。 质粒的拷贝数与不亲和性 1、质粒的拷贝数是指某种质粒在一个细菌细胞内的数目。 根据每个寄主细胞中质粒拷贝数的多少，把质粒分为严紧型复制质粒（拷贝数少，为1-5个）与松弛型复制质粒（拷贝数多，可达10-200份拷贝）。因此，作为载体的质粒应该是松弛型的。 2、质粒的不亲和性，有时也称为不相容性，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒，不能够在同一个寄主细胞系中稳定地共存的现象。在细胞的增殖构成中，其中必然有一种会被逐渐地排斥（稀释）掉。这样的两种质粒称为不亲和质粒。 质粒DNA的复制 Ori－复制起始点（origin，ori） （1）决定质粒自我增殖和拷贝数的主要元件。 （2）使繁殖后细胞维持一定量的拷贝数。 （3）一般情况下，一个质粒只含一个ori，构成一个独立的复制子。 （4）穿梭质粒含原核和真核生物2个复制子，以确保两类细胞中都能扩增。 基因工程使用松弛复制子，以获得更多的基因产品。 复制子 是一段包括复制起始位点，反式因子作用在内的DNA片段，其功能是通过复制使质粒能稳定存在宿主菌内（如E.coli）。 松弛复制子的特点 ①拷贝数多，10－200个，分子量小。 ②复制不受宿主细菌复制系统的限制，当宿主蛋白质合成受到抑制（如培养中加入氯霉素时）其拷贝数猛增至 1000－3000之多，该性质多基因工程技术十分有利。 ③分子量小，不具备自传递能力。 ④基因工程使用松弛型质粒，如含PBMI复制起点的质粒。 2. 标记基因 1、 标记基因的作用 1）指示外源DNA分子（载体或重组分子）是否进入宿主细胞 这种指示可以是选择性的（Ampr ，Tetr ，Kanr），也可以是非选择性的（如lacZ） 2）指示外源DNA分子是否插入载体分子形成了重组子。 * 这种指示也可以是选择性的（如TcS），也可以是非选择性的（如TcS， lacZα），绝大多数为后者。 **有的遗传标记基因可以完成上述两项作用。当充任第一作用时，最好是选择性标记基因；当完成第二作用时，目前多采用非选择性的—检测性标记基因。有的基因是不能用作选择性标记基因（lacZ等）。 2、?标记基因的种类 1）抗性标记基因（可直接用于选择转化子） 主要是抗生素抗性基因: Ampr ，Tetr ，Cmlr，Kanr，Strr 2）生化标记基因 其表达产物可催化某些易检测的生化反应，如lacZ 3、常用的遗传标记基因及其作用机制 1) 四环素抗性基因（ Tetr ，Tcr）