酶学-aptamer与核酶.pptVIP

Ⅰ. Aptamer 简介及其稳定性研究的重要性 Ⅱ. 核酶---10-23型脱氧核酶简要综述 Aptamer 指的是经体外筛选技术SELEX技术(指数富集配体系统进化技术)筛选出的能特异结合蛋白质或其他小分子物质的寡聚核苷酸片段。它是一系列单链核酸分子，与特异靶分子相结合，特异性如同抗体一样，对可结合的配体有严格的识别能力和高度的亲和力。 亲和力高---解离常数（ Kd）10-9M~10-12M 特异性强---能区分开不同配体上一个基团的差别 靶物质广泛---离子、小分子物质、蛋白、细胞…… 分子量小(8-15kD)、组织穿透力好---抗体（150kD） 易于合成---体外化学合成且可通过PCR扩增 易于修饰---可修饰各种信号物质，如荧光基团 低毒性、生物相容性好 基于aptamer自身的优势，有关抗体的研究，大部分都可以用aptamer代替，已广泛被应用： 生物传感器---物质检测、定量、定性分析… 临床诊断、治疗---肿瘤检测及靶向治疗… 新药开发、研制 …… Aptamer 的本质是核酸分子，因此要应用于生物体系中，就必须要经得起生物体内复杂环境的考验，特别是核酸酶的酶切、降解作用，从而对aptamer稳定性的研究就显得十分重要。 研究如何抗酶切就得把核酶的作用机理研究清楚，因此下面就针对核酶（10-23型脱氧核酶）做下简要的综述。 核酶( ribozyme, Rz) ：具有催化功能的RNA 核酶 脱氧核酶 ( deoxyribozyme,DRz)：具有催化功能的DNA 核酶的发现突破了酶是蛋白质的经典观念, 是人类对酶化学本质认识的飞跃, 启发了生物学家从进化角度思考研究生命起源问题, 补充和发展了“中心法则”。 核酶（Rz）广泛存在于由低等到高等的多种生物中。自然界中的Rz 多在分子内起作用(除RNase P 和核糖体外), 即Rz 的活性区域与作用底物序列在同一条链上, 其底物主要是带有磷酸二酯键的核酸。 核酶按分子大小分类可分为大分子核酶和小分子核酶2类大分子核酶又分为第1 类内元、第2 类内元和核糖核酸酶P( RNAseP) 的RNA 亚基等3 种, 它们都是由几百个核苷酸组成的结构复杂的大分子。大分子核酶可以看成是金属酶, 其催化作用与金属离子尤其是二价离子密不可分,。 脱氧核酶（DRz）是利用体外分子进化技术获得的一种具有高效催化活性和结构识别能力的单链DNA 片段。 。所有的DRz 都是单链分子, 如同单链RNA 分子一样, 能进行折叠、催化和展现酶活性。 根据其功能可分为七大类: 1.具有RNA 切割活性; 2.具有DNA 连接酶活性; 3.具有卟啉金属化酶和过氧化酶活性; 4.具有DNA水解活性; 5.具有DNA 激酶活性; 6.具有N2 糖基化酶活性; 7.具有DNA 戴帽活性。 10-23 DRz由15个脱氧核糖核苷酸构成一个环状催化中心，两侧臂各有8-10个脱氧核糖核苷酸构成酶分子的底物识别部位，其碱基序列与RNA底物通过Waston-Crick碱基配对的形式紧密结合，底物识别部位的特殊序列提供了特异性底物结合信息，能把10-23 DRz的催化性碱基环固定到RNA底物分子上。 脱氧核酶(下链) 与RNA 底物(上链) 通过碱基互补配对结合,箭头所示为切割位点,R = A 或G; Y = U 或C. 10-23 型脱氧核酶的结构 ①反应体系的pH值：在Ph7.0-8.5的范围内，10-23 DRz的催化速率与反应体系pH的升高大致呈对数-直线相关关系。 ②二价金属阳离子：是10-23 DRz赖以发挥活性的一个关键因素，其可能的机制为稳定10-23 DRz的反应过渡状态，有助于其折叠成活性结构。 ③缓冲液的种类：可以显著影响Mn2+和Cd2+等对10-23 DRz的作用。 ④温度：37℃条件下，10-23 DRz活性发挥良好。 ⑤底物的结构：底物RNA形成的二极结构或更高级结构可能遮蔽某些切割靶点。 ⑥底物结合区的长度和碱基构成：底物结合区越长，GC越多，剪切产物越不易与10-23 DRz解离，剪切速率将会下降，反之则10-23 Dm与底物RNA不易稳定结合。 10-23 DRz已在抗肿瘤、病毒感染性疾病、心血管疾病等的实验性基因治疗方面得到了广泛的研究，其研究领域也从最初的细胞外体系水平到细胞水平和动物水平，并取得了较为满意的效果。 Cairns等首先将10-23 DRz用于生物学研究中井成功地利用所设计的针对大鼠平滑肌(SMC)mRNA的10-23 DRz抑制了大鼠SMC的增殖，实验