实验24 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶.ppt

实验 24 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶 （红棕色，λ=505nm） 1．基质缓冲液 2．1.0mmol/L 2,4-硝基苯肼溶液 3．0.4mol/L NaOH溶液 4．2.0mmol/L丙酮酸标准液 5.　721/722型分光光度计 (2) 混匀，放置5min，在波长505nm处，以蒸馏水调零，读取各管吸光度，各管吸光度均减“1”号管吸光度为该标准管的吸光度值。 (3) 以吸光度值为纵坐标，对应的酶卡门氏活性单位为横坐标，各标准管代表的活性单位与吸光度值作图，即成标准曲线。 2．标本的测定 （1）在测定前取适量的底物溶液和待测血清，37℃水浴预温5min后使用；按下表进行。 　　　测定管吸光度减去样本对照管吸光度的差值为标本的吸光度。该值在校准曲线上查得ALT的卡门氏单位。 1．ALT是肝细胞损伤的诊断指标 　（1）急性肝细胞损伤的灵敏指标。 　（2）慢性活动性肝炎或脂肪肝时，转氨酶轻度增高（100U～200U），或在正常范围，且AST＞ALT。 　（3）肝硬化、肝癌时，ALT有轻度或中度增高，提示可能并发肝细胞坏死，预后严重。　 （4）其它原因引起的肝脏损害，如心功能不全时，肝淤血导致肝小叶中央带细胞的萎缩或坏死，可使ALT、AST明显升高。 （5）某些化学药物如异菸肼、氯丙嗪、苯巴比妥、四氯化碳、砷剂等可不同程度地损害肝细胞，引起ALT的升高。 2．其他疾病或因素亦会引起ALT不同程度的增高。如骨骼肌损伤、多发性肌炎等亦可引起转氨酶升高。 3．ALT活性降低见于磷酸吡哆醛缺乏症。 1．宜用血清标本测定。草酸盐、肝素、枸橼酸盐虽不抑制酶活性，但可引起反应液的轻度混浊。红细胞内ALT为血清中3倍～5倍，应避免溶血。 3．血清中ALT在室温（25℃）可以保存2d，在4℃冰箱可保存1周，在-25℃可保存1个月。 一般血清标本中内源性酮酸含量很少，血清对照管吸光度接近于试剂空白管（以蒸馏水代替血清，其它和对照管同样操作）。 对超过正常值的血清标本应进行复查。 4．严重脂血、黄疸及溶血血清可增加测定的吸光度。糖尿病酮症酸中毒病人血中因含有大量酮体，能和2,4-二硝基苯肼作用呈色，也会引起测定管吸光度增加。 因此，检测此类标本时，应作血清标本对照管。 5．绘制校准曲线时必须注意：由于赖氏方法的特点，每一个点必须做3管以上的重复测定，显色后以蒸馏水调节吸光度为零，读取各管的吸光度。求出各标准管的吸光度均值，减去“1”管吸光度均值后，对照赖氏单位绘制校准曲线。由于每批试剂都有差异，因此每换一个批号的试剂必须重新绘制曲线。 6．加入2,4-二硝基苯肼溶液后，应充分混匀，使反应完全。加入NaOH溶液的方法和速度要一致，NaOH浓度要准确。 1．重复性差 2．准确性差 3．试剂稳定性差 4．操作简便，实验条件要求不高，便于基层医疗单位开展。 1．赖氏法测定血清ALT时校准曲线为何不是直线？绘制校准曲线时应注意哪些问题？ 2．简述赖氏法测定ALT的反应原理和ALT测定的临床价值？ 3．简述固定时间法测定酶活性的优缺点。 * * 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） * 全国高等医药院校医学检验专业规划教材 临床生物化学检验实验指导 （第二版） 实验24 赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶 蚌埠医学院医学检验系　武文娟 实验目的 掌握：赖氏法测定血清丙氨酸氨基转移酶的原理和校准曲线的绘制。 熟悉：丙氨酸氨基转移酶测定的临床应用。 了解：固定时间法测定酶活性的特点与应用。 实验原理 在碱性条件下，丙酮酸苯腙和α-酮戊二酸苯腙的吸收光谱曲线有差别，在500nm~520nm处差异最大，以等摩尔浓度计算，丙酮酸苯腙的呈色强度约为α-酮戊二酸苯腙的3倍。据此可以计算出丙酮酸的生成量。 试剂与器材 150 97 57 28 0 相当于酶活性浓度 (卡门氏单位) 5.0 5.0 5.0 5.0 5.0 0.4mol/LNaOH溶液 混匀，37℃水浴20min 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 2,4-二硝基苯肼溶液 0.30 0.35 0.40 0.45 0.50 基质缓冲液 0.20 0.15 0.10 0.05 0 2.0mmol/L丙酮酸标准液 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1 0.1mol/L磷酸盐缓冲液 5 4 3 2 1 加入物(ml) 1．ALT校准曲线绘制 (1)按下表向各管加入相应试剂。 操作步骤 5.0 5.0 0.4mol/L NaOH溶液 混匀后，置37℃保温20min - 0.5 基质缓冲液 0.5 0.5 2,4二硝基苯肼溶液 混匀后，置37