(生物化学实验)综合实验一基因组DNA的抽提.ppt

注意事项 离心机使用时注意平衡 每人一个样品，全班同学同时离心、电泳。 基因组样品做好标记，交由老师统一保存，供下次实验使用。 严格按照基因组DNA抽提步骤操作。 实验报告只写一份，课后思考题可以提前准备起。 预先操作步骤 口腔拭子（消毒后的棉签擦拭两侧脸颊各10次） 棉签转置于1.5ml离心管，剪刀将棉签部分剪下，加入400ul缓冲液GA 加入20ul蛋白酶K溶液，涡旋10s混匀，56摄氏度放置60min。 每15min由老师帮助涡旋混匀。 实验原理 基因: DNA分子上具有遗传效应的特定核苷酸序列的总称 基因多态性： 是指正常人群中在某一基因位点上存在着2个或2个以上不同等位基因的现象。 可以是单核苷酸变异、缺失,或是某些高重复序列的拷贝数变异。 实验原理 单核苷酸多态性(single nucleotide pol ymorphism, SNP)： 是指是由单个核苷酸—A,T,C或G的改变而引起的DNA序列的改变，从而造成的不同物种间或人体内染色体基因组的多样性。 基因组DNA序列上群体发生频率大于1%的单个核苷酸差异。 实验原理 基因组多态性的研究的意义 与疾病易感性的联系（易感基因） 试图阐明人体对疾病、毒物和应激的易感性 与临床表型及预后的联系 阐明基因型（genotype)与表型(phenotype)的联系 与治疗效果的联系 药物代谢基因多态性 实验原理 常用的研究基因组多态性的DNA分子标记方法 基于southern blot的分子标记 限制片段长度多态性（Restriction Fragment Length Polymorphism, RFLP) 实验原理 基于PCR的扩增片段长度多态性（PCR-AFLP）以及扩增产物长度多态性（PCR-APLP）； DNA芯片技术 （SNP大规模检测） 实验原理 基于PCR的扩增产物长度多态性（PCR-APLP） 根据已知DNA片段两端序列设计引物，一端是等位基因特异性引物，另一端是共同引物； 对已知基因 DNA 片段再进行PCR特异扩增； 特异的引物配对可以扩增出某一特异基因型的片段， 根据扩增出来的DNA条带大小的差异，可以分析基因型（纯合型、杂合型） ALDH2的基因多态性分析 ALDH是包括乙醛在内的多种醛类物质代谢的关键酶,是酒精代谢中最重要的关键酶之一 19种同工酶。编码ALDH2的基因具有高度的遗传多态性并决定人对酒精的耐受性； 异常的ALDH2分子结构是其外显子12有一个G→A的点突变（即由ALDH2*1 突变为ALDH 2*2） 突变型ALDH2活性丧失, 抑制了乙醛氧化为乙酸的过程，导致乙醛在肝脏内大量累积， 饮酒后有脸红、心动过速、呼吸困难等不适反应，对酒精不耐受 ALDH2的基因多态性分析 实验内容和目的 本次实验将对不同个体的ALDH2多态性进行研究。 通过抽提不同个体基因DNA，应用聚合酶链反应-扩增片段长度多态性(PCR-APLP)分析法，对ALDH2基因外显子的特定片段同时进行特异性扩增, 3%琼脂糖凝胶电泳鉴定扩增产物，进而明确不同个体的ALDH2基因型，并进行统计分析。 综合实验分二次完成 实验内容 综合实验一：基因组抽提 选材：口腔粘膜脱落细胞 方法：口腔拭子法（消毒后的棉签擦拭两侧脸颊各10次） 步骤改动: 缓冲液GD和漂洗液PW中均已加入无水乙醇； 步骤2中用镊子将棉签挤干后取出改成在步骤3之后。