药学中的生物技术和方法抗体和免疫分析推荐.ppt

RIA Assay 免疫竞争结合分析---小分子抗原分析的基本方法 Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag [*AgAb: Precipitant↓] 放射性计数 常用分离沉淀技术 盐析法：饱和硫酸铵、硫酸钠 聚乙二醇法（w=6000） 特点： 快速，价廉，来源方便，受环境影响大 抗体免疫沉淀法 特点： 分离完全，非特异结合小，环境影响小，效价高，但成本高 固相吸附剂 RIA测量步骤 恒量的* Ag、Ab加入反应管中 加入待测样品、或标准品（已知浓度） 37℃或4 ℃温育 加入分离剂分离结合及游离部分 测定以总放射性为分母，测定* AgAb 为分子，计算结合%，以结合率为纵坐标，浓度为坐标，制作标准曲线 待测样品的结合率从标准曲线上求出浓度 Calibration curve ELISA（Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay） Sandwich ELISA 竞争法（略） High Convenience High Sensitivity 96-well plate 包被 封闭 结合 显色 酶标仪测定 hv 洗涤 洗涤 洗涤 终止 酶的底物 邻苯二胺(OPD) + H2O2 TMB ABTS HRP的底物 氧化产物(橙红色) 492nm吸收 2mol/L硫酸终止反应 AP的底物 硝基苯磷酸酯 对硝基酚(黄色) NaOH终止反应 405nm吸收峰 磷酸4-甲基伞酮 （荧光底物） 荧光偏振免疫分析 Principle of fluorescence polarization emitting dipole absorbing dipole ? excitation light polarized along z x z y I? I? detector Fluorescence polarization immunoassay Ag + Ab AgAb + Ag + * Ag * AgAb + * Ag High polarized fluorescence Low polarized fluorescence 偏振度r 时间分辨荧光免疫分析 荧光物质 荧光寿命(ns) 荧光物质 荧光寿命(ns) 非特异荧光背景 1～10 Sm3+ -β-NTA 65000 人血清蛋白 4.1 Sm3+-PTA 60000 球蛋白 3.0 Eu3+-β-NTA 714000 细胞色素C 3.5 Eu3+-PTA 925000 FITC 4.5 Tb3+-PTA 96000 丹黄酰氯 14 Dy3+-PTA 1000 罗丹明B 3.0 荧光背景和常用探针分子的荧光寿命 Lanthanide labeling Lanthanide labeling Ligand labeling CTTA BCPDA 镧系荧光底物法 DELFIA法 荧光试剂标记可以消除环境中稀土污染造成的荧光背景 固相时间分辨荧光 分子印迹和核酸适配体 思考题 什么是抗体？其结构特征是什么？怎么由基因编码一个抗体？ 什么是抗原决定簇？一个抗原分子是否只有一个抗原决定簇？ 抗体与抗原结合的特异性如何？为何有如此高的特异性？ 抗体有哪些应用？ 什么是抗体的Fab片段和Fc片段？其结构分别是如何？ 什么是单抗和多抗？分别是如何制备的？哪一种抗体的特异性高？为什么？ 什么是抗体库？ 什么是单链抗体？什么是ScFv？如何制备单链抗体？单链抗体有何应用？ 什么是二抗？二抗与一抗如何结合的？如何选择使用二抗？ 什么是Protein A？它如何与抗体结合的？ 什么是免疫分析？免疫分析有哪些特点？有哪些主要类型的免疫分析？ 抗体标记有哪些种类和方法？ 有哪几种通用抗体标记方法？分别如何使用？ 如何进行免疫染色观察？Western Blot的原理和要点是什么？ 什么是RIA，其分析方法的原理和要点是什么？ 什么是Sandwich ELISA？其分析原理和要点是什么？ 什么是荧光偏振免疫分析？其特点和原理是什么？ 什么是时间分辨荧光免疫分析？用