第十八章电泳2.ppt

第八节 双向电泳 电泳技术虽然是蛋白质分析的有用工具，但传统的单向电泳方法最多只能分析100种蛋白样品，并不适合分析细胞和亚细胞中的蛋白混合物。因为在一个复杂的混合样品中，若其中某些物质的等电点或分子量相似，或等电点和分子量有互补作用时，用单向凝胶电泳将所含组分全部分开是不能凑效的。 如果采用两种不同原理的电泳程序，特别是基于两种不同物理参数的电泳程序的结合，比如把一向电泳胶条转至另一种凝胶介质（pH和浓度与第一向电泳胶不同)上进行第二向电泳,这样能使分辨率提高几个数量级。能使混合样品得到有效分离。 2D Gel Electrophoresis run IEF gel in one dimension to separate by pI run SDSin 2nd dimension to separate by size 操作过程： 1 等电聚焦凝胶的准备: 第一维电泳是等电聚焦，在细管中（φ1-3 mm）中加入含有两性电解质、8M的脲以及非离子型去污剂的聚丙烯酰胺凝胶进行等电聚焦，在第一向电泳中，最重要的是用载体两性电解质建立pH梯度。 2 样品准备、加样:可溶蛋白的样品，如体液、细胞和组织的萃取物能直接用于双向电泳，但应稀释到合适的浓度。固体样品，如组织，细胞或组织培养液中的细胞，加样前应先粉碎和溶解。 3 等电聚焦: 变性的蛋白质根据其等电点的不同进行分离。 4 pH梯度的测定: 可用表面电极测量 5 平衡: 将凝胶从管中取出，用含有SDS的缓冲液处理30 min，使SDS与蛋白质充分结合。 6 SDS凝胶的准备 7 转移: 将处理过的凝胶条放在SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳浓缩胶上，加入丙烯酰胺溶液或熔化的琼脂糖溶液使其固定并与浓缩胶连接。平衡后的等电聚焦凝胶与SDS凝胶的良好接触是双向电泳结果的保证。 8 SDS电泳: 第二维电泳，结合SDS的蛋白质从等电聚焦凝胶中进入SDS－聚丙烯酰胺凝胶，在浓缩胶中被浓缩，在分离胶中依据其分子量大小被分离。 9 检测 考马斯亮蓝染色，银染，荧光标记，放射自显影等 人眼无法比较辨别分离的蛋白斑点，最好用机器识别 这样各个蛋白质根据等电点和分子量的不同而被分离、分布在二维图谱上。 染色方法 锌染或铜染 分辨量6－12ng 负染，快速简便且便宜，由于不染蛋白可以免去后续一些步骤 考马斯亮蓝染色 分辨量36－47ng 非特异性，但能与质谱分析相协调 银染 分辨量0.5－1.2ng 费时，昂贵，分辨力高，但特异性也不高 荧光染色 分辨量1－2ng 简便快速，有的染料很便宜，有的可以重复使用，兼有特异性与定量性 细胞提取液的二维电泳可以分辨出1000-2000个蛋白质，有些报道可以分辨出5000-10000个斑点，这与细胞中可能存在的蛋白质数量接近。 1975年，O’Farrell 首先运用双向电泳技术将大肠杆菌总蛋白分离出1100多个蛋白。后来此技术一直用于原核生物和真核生物总蛋白的分离。目前，随着蛋白组工程的发展，双向电泳技术越来越广泛的用于发现未知蛋白。 O’Farrell系统——ISO－DALT系统 1975年O’Farrell首先提出双向电泳系统，他用含有9mol/L尿素，2％NP-40，4％T，5％C的管状载体两性电解质凝胶等电聚焦作为第一向，聚焦后的凝胶在含SDS的缓冲液中平衡，再以琼脂糖包埋于垂直板状SDS凝胶的浓缩胶上，用Laemmli的不连续SDS梯度凝胶电泳作为第二向。 最后，利用放射自显影的方法得到了大肠杆菌蛋白提取液的1100种不同组分的5000个蛋白点的图谱。 这种技术当时被称为“蛋白爆炸”。 IPG-DALT系统 尽管ISO-DALT系统有很高的分辨率，但有很多问题需要解决，且主要问题出在第一向，如： 因阴极漂移而丢失碱性蛋白。 载体两性电解质pH梯度不稳定，受电场和时间的影响大，重复性不好等。 固相pH梯度的优点 pH范围可达2.5～11，在一张双向电泳图上可以得到整个细胞蛋白的分离点。 固相pH梯度技术的高分辨特性，使以它作为第一向的双向电泳分辨率更高。 固相pH介质是一类丙烯酰胺的衍生物，它与聚丙烯酰胺共价结合，pH梯度在聚合时就已形成，不受脱水，重新水化和电场等因素的影响，pH梯度十分稳定。 固相pH梯度上样量大，平衡时蛋白质不易被洗脱，易进入第二向凝胶。 将固相pH梯度凝胶和SDS凝胶聚合在支持膜上进行水平电泳，凝胶长度固定，不需要琼脂糖包埋，操纵简便，重复性高。 双向电泳的用途 　凝胶图像处理和双向电泳数据库 蛋白质的双向电泳显示了众多的蛋白质斑点,用图像扫描仪、荧光测定仪等采集原始图像,经背景和污点的校正,滤掉一部分背景及去除部分水平和垂直条纹,