医学生物信息基础_第8讲_聚合酶链反应教材教学课件.ppt

第九章;评价：* PCR是现今生物生命学科最关注、最爱用、 最欢迎的新技术。* 被誉为：20世纪80年代出现的具有划时代 的、生命学科中革命性的新技术。* PCR使生命学科发生变革，给生物医学的发 展注入无限活力。* 公认PCR最具发展前景，最有生命力的一项 新技术。* 最短时间获诺贝尔奖（86-94年）。* 多么高的评价都不过分。; 每个生物医学工作者都应做到 1)掌握PCR概念与内涵 2)掌握特异性扩增的原理 3)掌握PCR百万倍扩增目的DNA片段原理 4)学会PCR引物的设计，学会PCR操作技术 5)了解PCR的优缺点？应用前景？;一、问题提出 背景:  分子生物学、遗传学的兴起， 反向生物学的诞生 （核酸、遗传物质，基因型→表型）。 共同障碍： 如何在短时间内快速、获足够量、纯净的、 特异的目的DNA片段/基因供使用，可检测。; 1．基础理论研究的需要  DNA重组、基因克隆、HGP测序，探针制备 2．实际应用的需要  基因工程（基因表达）、基因诊断、基因治 疗，基因预防等给人类带来希望。;二、PCR的基本概念;前提：人工合成一对特定引物作向导， 始动DNA合成。 酶促：体外试管内进行酶促生化合成 （非化学合成）。 靶子：特导扩增目的靶序列（目的）。 高效：极微量模板、百万倍扩增 快速：短时高速完成实验。; 三、PCR工作原理 PCR的基本原理 变性、复性、半保留复制 PCR过程：3步曲 + 1循环 高温变性 90～97℃ 降温退火 45～55℃ 适温延伸 72℃左右 反复循环 ;（三）适温引物延伸（适温新链合成） 加入选定的DNA聚合酶，在其适宜温度（Taq 酶为65 - 72℃）进行DNA酶促合成反应，反应体系中的4×dNTP（底物A、C、G、T四种核酸），在引物3′端，在模板序列指导下，开始合成，即引物自5′→3′端延伸，合成一条与模板互补 之新链。; 反应体系中DNA产量增加一倍，（原模板+新合成DNA，半保留复制），若以此产物DNA总量为模板重新合成反应，新反应体系中模板量实际将增加一倍。;（四）循环指数扩增  重复前三个步骤， 由于每次循环后产物可作为下一次反应模板，DNA总量和模板量均较上一次循环增加一倍， 反复多次累积呈指数增加，如一分子DNA成单链后两个模板，一次循环后变为2分子DNA，变性后有4个单链模板，30次循环的 230＞106呈百万倍增加。;PCR原理;PCR原理;PCR原理;PCR原理;PCR原理;PCR原理;PCR原理;PCR原理;PCR原理;PCR原理; DNA以指数形式扩增(2n)，其中长片段以线性形式扩增 (2n+2)，最终主产物片段长度在两个引物之间。;TGAACGTAGTAGCATAGCAATGTGATCTCGACGATGCATCATGACATCGATTTGATCGAT;PCR原理;PCR 循环 – 第一步 – 加热变性;;;;;PCR product; PCR每次循环扩增一览表 (n≠0) 循环 起始模板 5′端锁定长链 短链靶序列 总拷贝数 0 2 0 0 2 1 2 2 0 4 2 2 4 2 8 3 2 6 8 16 4 2 8 22 32 …………………………………………………… 20 2 40 105 220+1 n 2 2n 2n+1-2n-2 2n+1 (恒定不变) (线性增加)(近似指数增加) (指数增加) ;从表中可知， 20次PCR循环后，反应产物DNA链拷贝数220 - 106，起始模板可略去不计，5′端长链数40个，只占总数40/220≈3.5×10-5.比例相当小。 当扩增30次后，其占比例更小，产物中 99.99%均为目的靶序列短链。 致于可能合成报少量小于靶序列的短小片段。由于进入下一循环后，引物结合不止，不可能大量扩增。;72℃;(二)PCR操作流程;加酶后参数;PCR反应体系;* 切记莫忘 模板变性要充分， 最好加酶前使模板充分变性