绿色荧光蛋白GFP-南开大学生物试验教学中心.PPT

免 疫 学 实 验 实验76绿色荧光蛋白（GFP）的转化表达及免疫印迹检测 绿色荧光蛋白（GFP） GFP 实验流程图 一、实验目的 1.熟悉转化表达的过程。 二、实验材料与用具 1、 菌种 （1） E.coli DH5α(pETH）菌株 （2）E.coli DH5α(pETH-GFP)菌株 （3）E.coli BL21菌株 （4）E.coli BL21 (pETH）菌株 （5）E.coli BL21 (pETH-GFP）菌株 三、实验原理与方法 （一）质粒的提取、酶切及琼脂糖凝胶电泳检测 碱裂解法提取质粒DNA的原理 §1、用试剂盒提取质粒DNA 酶切反应 每 20ul 酶切体系所需材料 无菌ddH2O 2ul 质粒DNA 15ul 10×Buffer 2ul EcoRI 1ul 总计 20ul 置37℃温箱酶切2hr。 酶切片断的电泳检测 制备0.8％琼脂糖凝胶板，加入适量的EB。 向酶切管里加入适量溴酚蓝，全部取出点样。 （二）感受态细胞的制备及转化 CaCl2法制备感受态细胞原理 CaCl2法制备感受态细胞操作要点 §2、氯化钙法制备感受态细胞 §3、转化 （三）GFP的诱导表达 §4、诱导表达 乳糖操纵子（Lac operon）的结构及阻遏作用 工程菌E.coli BL21(pETH-GFP)的表达原理 § 5、制备细胞裂解液 （四）聚丙烯酰胺凝胶电泳 （polyacrylamide gel electrophoresis, PAGE） SDS§ 6、加样、电泳 （五）免疫印迹（ immunoblotting ）  蛋白质印迹电转移 § 7、转膜 五、注意事项 Acr, Bis具有神经毒性，实验中应带手套操作。 待分离样品的质和量直接影响电泳效果。 如待分析的蛋白质分子量大，转移时间需延长。 电泳转移操作时，确保滤纸、膜、凝胶其间无气泡存在。 六、思考与讨论 题 实验77干扰素（IFN）的转化表达及双抗体夹心法检测 本实验以基因工程干扰素（Interferon,IFN）和其特异性抗体为材料，利用酶联免疫吸附试验（ELISA）的双抗体夹心法测定基因工程干扰素在发酵液中的含量，在酶标仪上观察到放大的光信号，借此检测微量基因工程干扰素。 干扰素（IFN） 一、实验目的 1.熟悉和掌握酶联免疫吸附试验 的原理、种类和用途。 二、实验原理 酶联免疫吸附试验 抗原或抗体吸附到固相载体的表面仍保持其免疫活性。 抗原或抗体与酶相结合所形成的免疫复合物仍保持其免疫活性和酶催化活性。 结合物和相应的抗体或抗原反应后，结合在免疫复合物上的酶在遇到相应的底物时，可催化底物水解、氧化或还原，从而产生有色物质。 双抗体夹心法酶联免疫反应原理图 生物素—亲和素系统（biotin-avidin system，BAS） 应用BAS标记抗体是70年代后期发展的一类新型生物反应放大技术。 本实验检测原理示意图 酶和底物 三、实验材料与用具 1、 菌种 （1）E.coli BL21(pETH-IFN)菌株 （2）E.coli BL21(pETH)菌株 四、实验内容与方法 （一）质粒的提取 （二）感受态细胞的制备及转化 （三）IFN的诱导表达 （四）夹心法检测 1、包被（Coating) 包被抗体（兔抗干扰素多抗） 100μl/孔 ，室温放置2hr。 2、封闭 （Blocking） 去反应液，用稀释液洗涤1次， 加入封闭液，200μl/孔 ，4℃过夜 3、检测样品 洗涤的目的是洗去反应液中没有与固相抗原或抗体结合的物质以及在反应过程中非特异性吸附于固相载体的干扰物质。 聚苯乙烯塑料对蛋白质的吸附作用是普遍性的。因此在ELISA测定的反应过程中应尽量避免非特异性吸附，而在洗涤时又应把这种非特异性吸附的干扰物质洗涤下来。 吐温（Tween），是聚山梨酯一类物质，为非离子型的表面张力物质，它的洗涤效果好，常作为助溶剂。 ELISA检测中，在标本和结合物的稀释液和洗涤中加入0.05～0.1%的Tween－20，具有减少非特异性吸附和增强抗原抗体结合的作用。 加样顺序 五、注意事项 每次实验均应设置： 空白对照（以稀释液代替标本）为本底值 阴性对照（E.coli BL21 (pETH) 菌株的细胞裂解液） 阳性对照 在分析实验结果时应扣除本底值，并且在阳性对照﹥阴性对照(0.2)﹥空白对照(0.05)时实验成立。 手工冲洗时应确保洗液不从孔中溢出，用洗板机冲洗时，应确保各道冲洗头进出洗液通畅。 底物采用OPD（492nm测定）较灵敏，但稳定性差，TMB（450nm测定）较稳定，