[工程科技]2011HBU分子生物学实验.ppt

分子生物学实验 课程名称： 分子生物学实验 学分/学时：2/34 课程层次： 专业必修课 修读类型： 必修 考核方式： 实验报告、测验 适用专业： 生科各专业 李继刚 周志军 目 录 实验一、琼脂糖凝胶电泳 实验二、PCR基因扩增技术 实验三、电泳分析 实验四、扩增片段的回收 实验五、扩增片段与T-载体的连接 实验六、感受态细胞制备 实验七、重组质粒的转化 实验八、转化质粒的提取 实验九、提取质粒的电泳检测 实验十、质粒的限制性酶切分析 实验十一、酶切电泳检测 小测 实验一、琼脂糖凝胶电泳 一、实验目的　　 通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术； 熟悉微量移液器的使用； 二、实验原理 DNA在琼脂糖凝胶中泳动时有电荷效应和分子筛效应。 核酸为两性分子，在pH3.5时，整个分子带正电；pH 8左右时，碱基几乎不解离，整个分子带负电。 在碱性环境下，相同碱基数量的双链DNA几乎具有等量的净负电荷，能以同样的速度向正极方向移动。具有不同的相对分子质量的DNA片段泳动速度不一样，可进行分离。DNA分子的迁移速度与相对分子质量的对数值成反比关系，可以近似用于估算分子的大小。 可以分离相对分子质量相同，但构型不同的DNA分子。 　共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 三、仪器、材料与试剂 （一）仪器 （二）材料 1. 提取的质粒DNA 2.相对分子质量标准品(DL2000) （三）试剂　 1．50×TAE储液(pH8.0)：使用时稀释 50倍1×TAE。 2．凝胶加样缓冲液：0.2%溴酚蓝，50%蔗糖 3. 琼脂糖（1.0%浓度） 4.10000×Goldview DNA荧光染料(替代溴化乙锭EB)。 四、实验操作步骤 凝胶板的制备 加样 电泳 结果观察 　 　相关知识 电泳：泳动速度决定于？ 琼脂糖凝胶 　天然琼脂（Agar）是一种多聚糖，主要由琼脂糖（Agarose，约占80％）及琼脂胶（Agaropectin）组成。琼脂糖是由半乳糖及其衍生物构成的中性物质，不带电荷。而琼脂胶是一种含硫酸根和羧基的强酸性多糖，由于这些基团带有电荷，在电场作用下能产生较强的电渗现象，加之硫酸根可与某些蛋白质作用而影响电泳速度及分离效果。琼脂糖透明无紫外吸收，因此，目前多用琼脂糖为电泳支持物进行平板电泳。 核酸分子大小与琼脂糖浓度的关系 核酸构型与琼脂糖凝胶电泳分离的关系 不同构型DNA的移动速度次序为：共价闭环超螺旋DNA（cccDNA）＞直线DNA（LDNA，2条链发生断裂）＞开环的双链环状DNA（ocDNA，1条链发生断裂）。 影响迁移率的因素 DNA分子的大小、琼脂糖凝胶的浓度、DNA的构象、所加电压 一般5V/cm、电场方向、嵌入染料的存在、电泳缓冲液的组成。 常用染料 EB:溴化乙锭（3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶溴盐Ethidium　Bromide，EB），EB能插入DNA分子碱基对之间，导致EB与DNA结合。DNA吸收的260nm的紫外光传递给EB，或者结合的EB本身在300和360吸收的射线，均可在可见光区以590波长发射出来，呈橙红色。 EB染料优点：染色操作简便，快速，室温下15-20min；不会使核酸断裂；灵敏度高，10ng或更少的DNA即可检出；可以加到样品中可胶中。 Goldview:新型低毒，高灵敏度染料，加入凝胶中，价格较昂贵。 五、实验结果与讨论 根据观察结果，绘图。 分析此次实验的电泳结果。 二、聚合酶链式反应 PCR 实验目的 1. 掌握DNA特异性片段的PCR体外扩增的原理； 2. 熟练进行常规PCR体外扩增的基本操作。 （一）简介 聚合酶链式反应：（Ploymerase Chain Reaction, PCR）诞生于1985年，它是根据生物体内DNA复制的某些特点而设计的在体外对特定DNA序列进行快速扩增的一项技术。 1. PCR技术的发明者：美国Cetus 公司的Kary Mullis ，因此获得1993年度诺贝尔化学奖。 2. 操作过程的简化依赖于以下两项技术： 1）热稳定性Taq DNA聚合酶的应用； 2）自动化热循环仪的设计成功。 该项技术对分子生物学及其相关学科的基础研究和诊断应用等方面产生着革命性的影响。 体内DNA复制过程的体外模拟 （二）基本原理 1．PCR的两个重要特征： 1）能合成DNA的特定序列； 2）特定序列的大量扩增。 引物的位置将决