08蛋白质组学PPT.ppt

功能上相互独立又互相依赖，只有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录因子活性 第一向IEF电泳 传统O’Farrell系统双向电泳的缺陷。 Bjellgvist等发展并完善了固相pH梯度等电聚焦技术，G?rg等成功地将之应用于双向电泳。 优点 固相pH梯度等电聚焦的优点 克服了载体两性电解质阴极漂移等缺点。 稳定的可以随意精确设定的pH梯度。 尤其可在较窄的pH范围内进行第二轮分析，大大提高了分辨率及重复性。 第二向SDS电泳 垂直板电泳 水平超薄胶电泳 2-DE技术的缺点 极酸、极碱性蛋白质，疏水性蛋白质，极大蛋白质、极小蛋白质以及低丰度蛋白质用此种技术难于有效分离。 胶内酶解过程费时、费力，难于与质谱联用实现自动化。 新型非凝胶技术 液相色谱法 liquid chromatography，LC 毛细管电泳 capillary electrophoresis，CE 液质联用技术（LC-MS/MS） 蛋白质混合物直接通过液相色谱分离以代替2-DE的分离，然后进入MS系统获得肽段分子量，再通过串联MS技术，得到部分序列信息，最后通过计算机联网查询、鉴定蛋白质。 根据蛋白质带电性及疏水性不同，用MS分离多肽复合物。 多维色谱技术（LC/LC-MS/MS） 多维蛋白质鉴定技术(multidimensional protein identification technology) （三）蛋白质组研究中的样品分析鉴定 传统方法：蛋白质微量测序 氨基酸组成分析 新型蛋白质鉴定技术 —— 质谱（MS）法 基本原理：样品分子离子化后，根据离子间质荷比（m/z）的差异来分离并确定样品的分子量。 “软电离”的特点 分子电离时保留整个分子的完整性，不会形成碎片离子。 灵敏度高、快速、能同时提供样品的精确分子量和结构信息、既可定性又可定量、并能有效地与各种色谱联用来分析复杂体系。 基质辅助激光解吸/电离飞行时间质谱（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry，MALDI-TOF MS） 电喷雾质谱（electrospray ionization mass spectrometry， ESI-MS） 主要质谱类型 鉴定和注释蛋白质的路线 通过肽质谱指纹图（peptide mass fingerprinting，PMF）和数据库搜寻匹配 通过测出样品中部分肽段二级质谱信息或氨基酸序列标签和数据库搜寻匹配 目 录 仪 器 MALDI-TOF质谱仪：灵敏度高（可达fmol），分析速度快，谱图简单易于解析以及受缓冲液、盐份的干扰小 肽质谱指纹图在数据库中匹配不成功的可能原因 样品量太少，PMF图信噪比太低，输入库中搜寻的数据质量不好。 2-DE胶上所取的一个蛋白质点并非单一蛋白质，所获PMF图实际上是两个以上蛋白质的混合图。 操作中角蛋白或其他蛋白质的污染 蛋白质发生了较多的转译后修饰，数据库中未有记载 所用胰蛋白酶质量不够好，蛋白酶自酶解片段多 未知的新蛋白质 数据库规模太小 续： 组织切片或印片原位质谱分析技术 两级飞行时间串联质谱（MALDI-TOF/TOF） 傅里叶转换回旋共振质谱（FTMS） 表面增强激光解吸/电离飞行时间质谱（SELDI-TOF-MS） 联合技术精确鉴定蛋白质 （四）蛋白质组学研究的生物信息学 生物信息学是蛋白质组学研究的一个不可缺少的部分。 构建和分析双向凝胶电泳图谱 数据库的搜索与构建 应 用 蛋白质组数据库是蛋白质组研究水平的标志和基础 瑞士的SWISS-PROT拥有目前世界上最大、种类最多的蛋白质组数据库。 目前应用最普遍的数据库是NRDB 和dbEST数据库。 dbEST数据库 由美国国家生物技术信息中心（NCBI）和欧洲生物信息学研究所（EBI）共同编辑，包括许多生物体的表达序列标签（EST） 肽序列标签(PST)或部分序列信息最适合查寻 概念：把一个基因组表达的全部蛋白质或一个复杂体系中所有的蛋白质进行精确的定量和鉴定。 （五）定量蛋白质组学研究 低丰度蛋白质检测困难 蛋白质表达量差异很小，如在50%以下时，精确定量成为瓶颈 蛋白质表达的瞬时变化