4 生物大分子相互作用分析技术(基础医学与医学实验技术)PPT.ppt

第六章 生物大分子相互作用 分析技术; 第一节 生物大分子相互作用分析的意义 第二节 常见的生物大分子相互作用分析方法 第三节 生物大分子相互作用分析新进展（FRET、SPR）;真核生物细胞 eukaryotic cell 原核生物细胞 prokaryotic cell ;原核生物细胞结构;动物细胞;分子水平;DNA;Protein complex;蛋白质组学的分类;蛋白质结构和序列特点 蛋白质进化过程和保守序列 蛋白质表达谱 蛋白在细胞内的定位及其相关联的细胞器或结构 蛋白质翻译后修饰情况 了解与其相关联的其他细胞蛋白质;蛋白质同源二聚体(homodimer) 蛋白质异源二聚体(heterodimer) 蛋白质多聚体(polymer) 蛋白质-DNA复合物(protein-DNA complex) 蛋白质-脂质复合物(protein-lipid complex) 蛋白质-RNA复合物(protein-RNA complex) DNA-DNA复合物(DNA-DNA complex) ……;第二节 生物大分子相互作用分析技术;生物大分子相互作用分析研究思路;;GST 融合蛋白技术(GST pull-down) 免疫共沉淀(Immunoprecipitation, Co-IP ) 串联亲和纯化(Tandem Affinity Purification，TAP) 酵母双杂交系统(Yeast two-hybrid) 噬菌体展示(Phage display) 细胞内蛋白质共定位(Co-localization) 荧光共振能量转移(fluorescence resonance energy transfer，FRET) 表面等离子共振(surface plasmon resonance，SPR) ……;1.GST融合蛋白技术 （GST pull-down assay）;GST pull-down assay Purification of protein;Tags Pull-Down 方法的组成;R;GST;GST pull-down 应用;GST pull down验证两种已知蛋白质（X-Y）的相互作用;2. 免疫共沉淀（ immunoprecipitation，Co-IP ）; 基本原理：当细胞在非变性条件下被裂解时，完整细胞内存在的许多蛋白质－蛋白质间的相互作用被保留了下来。如果用蛋白质X的抗体免疫沉淀X，那么与X在体内结合的蛋白质Y也能沉淀下来。;实验设计思路;实验流程;基础：细胞在非变性条件下裂解时，完整细胞内许多蛋白质之间的结合保持下来。 要求：在一系列操作过程中保持蛋白质复合体不变;Co-IP 应用;免疫共沉淀验证两种已知蛋白质的相互作用;3.串联亲和纯化（Tandem Affinity Purification，TAP）;串联亲和纯化技术的优势;双亲和标签：;实验流程;4. 酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ）;基本原理： 基于对真核生物调控转录起始过程的认识。;酵母双杂交（ yeast two-hybrid system ）;实验设计思路;Yeast Two-Hybrid Assay;优势：;酵母双杂交方法的应用;;酵母双杂交结果; X-β-半乳糖苷酶蓝白斑显色分析;酵母双杂交测序结果;5.噬菌体展示技术（Phage display）;特 点;Used for cloning foreign genes among other applications Proteins and peptides are fused to the Capsid (surface) of the phage The combination of the phage and peptide is known as a Fusion Protein;phages;Filamentous phages;(a) Adenovirus. (b) Rotavirus. (c) Influenza virus (courtesy of George Leser). (d) Vesicular stomatitis virus. (e) Tobacco mosaic virus. (f) Alfalfa mosaic virus. (g) T4 bacteriophage. (h) M13 bacteriophage.;M13噬菌体的生活史;丝状噬菌体的基因及蛋白结构;载体的插入位点 ;pIII 和pVIII 噬菌体展示系统;T7噬菌体展示筛选系统; 优点： 　　A. 高通量的淘选：将靶标分子（抗体）固定在固相载体上，加入噬菌体展示肽库（噬菌体的数量可达1011 PFU），