[理学]--转录因子.ppt

转录调节因子 按功能特征，真核基因顺式作用元件分为：启动子（promoter）、增强子（enhancer）、沉默子（silencer ） 并非任何细胞型特异的蛋白在任何情况下都起作用，而是取决于核心启动子提供一个合适的环境来决定基因是被激活还是被抑制。 构建多个启动子连接多个基因的表达载体，虽然可以实现同时转入多个基因的愿望，但这种载体一方面构建困难，另一方面如果引入的启动子之间仅仅有90bp 的同源性顺序，导入生物体内，就会引起所谓的基因表达”共抑制”现象，而使基因沉默。因此，将极性启动子人工改造为高效双向表达的启动子，对于促进基因工程的进展具有重要意义。 有研究表明，将单向极性植物表达启动子改造为能够双向表达的启动子对于植物基因工程研究和应用具有不可估量的作用，其应用前景十分广阔。 Promoter elements are defined by mutations and footprinting. ?用突变法和印迹试验法确定启动子元件. 在合适的体外或体内检验系统中, 启动子是根据其附着序列产生转录的能力来进行定义的. 通过从一侧逐段缺失来确定启动子的边界. 当一段缺失不会阻碍RNA合成, 而下一段缺失使转录不再发生时, 那么我们可以确定启动子的边界必然存在于两者之间. 启动子克隆的几种方法 启动子的克隆对于构建基因工程载体，表达目的蛋白有着重要的意义。启动子克隆的方法很多，从常用的利用启动子探针型载体筛选启动子到PCR方法的应用，此后相继问世的一些基于PCR法的克隆启动子技术，像I-PCR、P-PCR、SSP．PCR、YADE、TAIL-PCR等，为克隆启动子提供了更可靠，更合理的方法。 利用启动子探针载体筛选启动子 利用启动子探针载体筛选启动子的过程为，先选用1种适当的限制性核酸内切酶消化切割染色体DNA，然后将切割产生的DNA限制片段群体与无启动子的探针质粒载体重组，并按照设计的要求使克隆的片段恰好插在紧邻报告基因的上游位置；随后再把重组混合物转化给寄主细胞，构建质粒载体基因文库，并检测报告基因的表达活性。 利用PCR技术克隆启动子 　　即根据发表的基因序列，设计引物，克隆基因的启动子，由于PCR法简便快捷，近年来人们较多采用此方法克隆基因启动子。 　　苏宁等根据已报道的水稻叶绿体16SrRNA启动子基因序列设计5‘启动子序列的引物，以水稻叶绿体DNA为模板，PCR扩增出16SrRNA基因5’启动子区的片段，酶切克隆到pSK的SacI和SphI位点，构建测序载体质粒pZ16S，进行序列测定，结果表明所克隆的片段长为144bp，含有SD序列。同源比较结果表明，所克隆的片段与水稻叶绿体16SrRNA启动子序列具有100％的同源性。 环状PCR 　　环状PCR包括I-PCR(Inverse-PCR)和P-PCR(Panhandle-PCR)。这2种PCR都是根据一端已知序列设计的嵌套式引物进行PCR。 I-PCR的实验程序包括，基因组DNA经酶切后用T4DNA连接酶进行自连接，产生环状DNA片段；以环化产物为底物，用根据已知片段设计的反向引物进行PCR扩增，从而得到含有未知片段的扩增产物 P-PCR 是由Jones等提出的利用末端反向重复序列与已知序列互补配对形成环状单链模板，有效增强了引物与模板结合的特异性。反应需要3个根据已知序列设计的引物，3个引物在已知序列内呈线性排列，其中第3个引物可作为接头使用，可与已知序列互补配对形成锅柄状单链模板。其过程为，首先酶切基因组DNA，产生5‘或3’粘末端，然后连接上合适的接头(primer 3)，连接好后最好用核酸外切酶I除去多余的接头，由于连接上的接头与已知序列是反向重复序列，变性后的DNA单链可退火形成锅柄状单链模板，之后分别用3个单引物进行3次PCR扩增，能有效地扩增2～9kbp的大片段未知序列 。 利用载体或接头的染色体步行技术克隆基因启动子 　　 这类方法的第一步都是酶切基因组DNA，连接载体或接头，既可以用pUCl8等质粒载体，也可以使用λDNA等噬菌体载体，只要选用的载体带有合适的酶切位点；同样根据实验需要，接头既可以是双链也可以是单链，然后根据基因组DNA序列设计的特异引物和载体的通用引物或接头序列进行扩增。 TAlL-PCR 很早就有用随机引物的PCR，但由于无法有效地控制由随机引物引发的非特异产物的产生，所以一直未能广泛应用。近年来由IJiu等设计的TAIL-PCR(Termal Asymmetric Interlaced PCR)又叫热不对称交错PCR，则解决了这个问题，后来有研究表明，经改良过的TAIL-PCR成功地从突变体中克隆到外源插入基因的旁侧序列，从而为启动子的克隆提供了有效的新方法。