[生物学]抑制性削减杂交PCR1.docVIP

抑制性削减杂交PCR mRNA群和获得仅在一种mRNA群表达而在另一种mRNA群没有表达的克隆子的强有力的技术。虽然分析差异表达有几种不同的方法，但削减杂交背后的基本理论却非常简单。首先，两组mRNA均转化为cDNA：我们将含有特异(差异表达的)转录物称为“tester”，对照cDNA称为“driver”。Tester和Driver cDNA进行杂交，接着去除杂交序列。结果，保留的未杂交的cDNA就代表了那些仅在tester组表达，而在driver组不表达的mRNA。 Molecular basis of PCR-Select cDNA subtraction 虽然传统的减法杂交方法在某些研究中已成功运用，但要求好几轮的杂交且也不适合鉴定稀有信息。CLONTECH PCR-Select( cDNA削减杂交是唯一克服了传统减法杂交的这些缺点的方法。图1表示PCR-Select过程的简短回顾。本方法的几个特点使其具有高效和可重复性。方法仅要求0.5--2(g polyA+ RNA，花3—4天时间，也不用分离ss和ds分子。而且，抑制性PCR预防了不需要的扩增而使目标分子得到富集。 图2详细地描述了发生在PCR-Select cDNA过程中消减杂交分子事件。首先，cDNA从0.5-2(g的两种比较组织材料polyA+ RNA合成。Tester和driver cDNA以RsaⅠ酶切，该酶为一四碱基限制性内切酶，能产生平末端。Tester cDNA接着分成两部分，每一部分连接上一个不同的cDNA adaptor。 Adaptor的末端无磷酸基团，因此仅有adaptor的一链与cDNA 5’末端相连（防止adaptor自连）。两adaptor具有不同的序列，这样当残留末端被补平后就能够同两个不同的PCR引物退火(Appendix B)。 接着进行两轮杂交。在第一轮杂交中，将过量的driver cDNA 加入到两份tester样品中，然后热变性和退火，在每一样品产生a、b、c和d分子(图2)。由于杂交二级动力学的原因，高丰度分子退火快，因此高和低丰度序列在a型分子中的浓度趋于均衡。同时，a型的双链分子明显地富集差异片段，就如与driver杂交中没有差异表达的c型ss分子明显富集。 在第二次杂交期间，两份第一次杂交的样品不经变性直接混合。现在，仅有保持平衡的和消减的ss tester cDNA能够重新配对形成新的e型杂交体。这些新杂交体成为具有不同接头的ds DNA分子，分别为tester1(与adaptor1相连)和tester2(与adaptor2相连)。将新变性的driver cDNA加入无需再次变性的已经第一次杂交反应的两混合物，进一步富集差异表达序列e型分子。经DNA多聚酶补平末端后，e型分子—差异表达的tester序列—在5’和3’端具有与巢式引物配对的不同的退火位点。 接着整个分子群进行PCR以扩增需要的差异表达序列。在PCR中，a和d分子无引物退火位点，因而不能被扩增。由于抑制性PCR效应，绝大多数b型分子形成盘状结构而阻止其指数扩增(Appendix A)。c型分子仅有一个引物结合位点而仅能被线性扩增。仅有e型分子，有两个不同adaptor，能被指数扩增，产生均衡的差异表达序列。 进而，用巢式引物进行第二次PCR扩增以进一步减少背景和富集差异表达序列。此时，差异表达的cDNA就能直接插入T/A克隆载体。可以选择使用接头1的Not I (Sma I, Xma I)位点和接头2R的Eag I (例，使用CLONTECH’s Advantage PCR Cloning Kit, #k1901-1)或任何使用RsaⅠ位点作为adaptor/cDNA 连接的载体。然后，差异表达的RNA能被测序、杂交分析鉴定。PCR混合物也可用作杂交探针进行DNA文库筛选。 PCR-Select differential screening 获得消减cDNA文库后，重要的是确认代表差异表达基因的的单个克隆，This is typically accomplished by probing Northern blots with randomly selected, subtracted clones。然而这既耗时又低效，尤其是关系很近的RNA populations相互比较——消减文库中可能包含相当数量的假阳性。在Northern杂交分析前利用消减文库的差异筛选有助于减少假阳性，节省时间和精力。在差异显示中，来自于杂交文库的克隆子与来自于检测子或者驱动子的标记探针进行点杂交。那些能被检测子探针识别而不能被驱动子探针识别的克隆子就能确认是差异表达的片段。PCR-Select differential screening试剂盒中包含所有差显文库检测