[生物学]宁医2012年 第二章基因工程制药.ppt

卫生部“十二五” 规划教材 生物技术制药（第二版） 第二章 基因工程制药 Genetic Engineering Pharmaceutics 主讲人：赵云生 本 章 内 容 一、概 述 二、基因工程制药基本知识 三、基因工程药物的改造 四、基因工程药物的质量控制 五、基因工程药物的应用实例 一、概述 基因工程：将一种生物的基因分离出来，在体外进行酶切和连接，插入载体构成遗传物质的新组合，导入另一种宿主细胞使目的基因得到复制和表达的技术。 基因工程制药（Genetic Engineering Pharmaceutics）：利用基因重组技术将外源基因导入宿主菌或细胞进行大规模培养，以获得蛋白质药物的过程。 传统内源生理活性物质来源及制备困难、价格高昂，而且在制备过程中可能受到的病毒、衣原体、支原体等的感染，促使人们寻求安全、实用、疗效可靠的新方法来制备生物药物 应用基因工程技术可十分方便且有效地解决上述问题，从量、质上都可以得到改进，且可以创造全新物质。 一、概述 基因工程制药主要是指生产医用活性蛋白和多肽，主要类别如下： 激素：胰岛素，生长激素 免疫性蛋白：单克隆抗体，疫苗 细胞因子：干扰素，白细胞介素 酶类：尿激酶，超氧化歧化酶 主要基因工程药物 一、概述 基因工程生产药物的优点 可大量生产过去难以获得的生理活性多肽和蛋白质 可以提供足够数量的生理活性物质，以便研究其生理生化和结构，扩大这些物质的应用范围； 可以发现、挖掘更多的内源性生理活性物质； 可以通过基因工程和蛋白质工程改造内源性生理活性物质在作为药物使用时的不足； 利用基因工程技术可获得新型化合物，扩大药物筛选来源。 一、概述 基因工程药物生产发展迅速。 1977年，重组生长激素抑制因子克隆成功； 1982年，第一个基因工程药物--重组人胰岛素在英、美获准使用 我国1989年，第一个基因工程药物干扰素批准上市；1992年第一个基因工程乙肝疫苗投入市场。 目前，全球上市的基因工程药物有140多种，有1700多种处于临床研究阶段，2600多种在实验室研究阶段。 二、基因工程制药基本知识 基因工程药物制造的主要程序： 获得目的基因 目的基因克隆 构建重组表达载体 将DNA重组体转入宿主菌构建工程菌或工程细胞 工程细胞培养 表达产物的分离、纯化 除菌过滤→半成品检定→成品检定→包装。 基因工程药物制造的主要程序： 基因工程药物生产的上游和下游 上游阶段： 主要是分离目的基因、构建工程菌(细胞)。 目的基因获得后，最主要的就是目的基因的表达。 选择基因表达系统主要考虑的是保证表达的蛋白质的功能，其次是表达的量和分离纯化的难易。 此阶段的工作主要在实验室内完成。 基因工程药物生产的上游和下游 下游阶段： 从工程菌的大量培养一直到产品的分离纯化和质量控制。 此阶段是将实验室的成果产业化、商品化，主要包括工程菌大规模发酵最佳参数的确立，新型生物反应器的研制，高效分离介质及装置的开发，分离纯化的优化控制，高纯度产品的制备技术，生物传感器等一系列仪器仪表的设计和制造，电子计算机的优化控制等。 基因工程药物制造的技术流程： 目的基因常用制备方法 目的基因的制备是基因工程制药的第一步。 其制备方法主要有：化学合成法、PCR法、基因文库法和cDNA 文库法等 1、化学合成法 化学合成DNA的实质是按照序列要求将脱氧核苷酸单体一个个接上去，每接一个单体就是一个循环反应，包括：基团保护、分离、缩合、分离、去保护五大操作单元。 从反应机理上来讲，DNA化学合成有磷酸二酯法、磷酸三酯法及固相亚磷酸液三酯法 固相亚磷酸液三酯法应用最为广泛。 目的基因常用制备方法 1、化学合成法 先决条件：必须知道目的基因的核苷酸排列顺序，或知道目的蛋白质的氨基酸顺序，再按相应的密码子推导出DNA碱基序列。 方法：合成目的基因DNA不同部位的两条链的寡核苷酸短片段，再退火成为两端形成粘性末端的DNA双链片段，然后将这些双链片段按正确的次序进行退火连接成较长的DNA片段，再用连接酶连接成完整的基因。 大片段目的基因可以通过小片段寡聚糖拼接形成，方法有小片段粘接法、大片段酶促法。 根据目的基因全序列，分别合成12-15碱基长的单链DNA小片段 目的基因常用制备方法 1、化学合成 人工化学合成基因的限制： 不能合成太长的基因，只适用于克隆小分子肽的基因。 人工合成基因时，遗传密码的简并会为选择密码子带来很大困难， 如用氨基酸顺序推测核苷酸序列，得到的结果可能与天然基因不完 全一致，易造成中性突变。 费用太高。 目的基因常用制备方法 2、PCR法（聚合酶链反应或PCR扩增技术，1985年发明） 原理：根据生物体内DNA复制原理，在DNA聚合酶催化和dNTP参与下 ，引物依赖DNA模板特异性地扩