血浆-血清-体液蛋白质组学().ppt

* 高丰度蛋白的去除和分级技术 * 高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测 A: Albumin B: Transferrin C: Apo A-I lipoprotein D: Haptoglobin b-chain E: a1-Antitrypsin PPI Website Oct 2002?，Plasma Proteome Institute * IPG4-7 A:原血 B:低丰度蛋白 IPG4-7 未去除高丰度蛋白的肝癌患者 血浆的2-DE分离结果 去除高丰度蛋白的肝癌患者 血浆的2-DE分离结果 高丰度蛋白严重干扰了低丰度蛋白的检测 肝癌患者血浆去除高丰度蛋白前后2-D分离结果 * 高丰度蛋白的去除策略 亲和色谱柱技术对高丰度蛋白进行选择性分离 抗体的亲和法 染料的亲和法 抗体亲和法 利用抗原抗体反应的原理，用针对血浆中多种高丰度蛋白的 单克隆或多克隆抗体来特异性去除血浆中的高丰度蛋白 染料亲和法 通过高丰度蛋白与染料环结构之间复杂的静电、疏水及氢键 相互作用去除血浆中的高丰度蛋白。特异性相对较低。 * 正常人血浆 MARS亲合柱 （结合组分-BF、流出组分-FF） 结合组分、流出组分蛋白的胰蛋白酶切 肽段的阳离子交换色谱分离 反相色谱分离－离子阱质谱鉴定 Sequest软件数据检索 SepproTM MIXED12亲合柱 （结合组分-BF、流出组分-FF ） 数据整合与分析 去除血浆高丰度蛋白的技术路线 * Immuno-affinity capture affinity capture biochemical biophysical Mechanism antibody-based system dye affinity molecular weight, density, hydrophobicity, surface charge and isoelectric point. Methods expensive only deplete albumin, nonspecific not protein-specific, variable capacities, limited reproducibility Shortcoming deplete multi-high abundant proteins cheap simple, convenient Merit HPPP Attempts for the depletion of high abundant proteins * 多重亲和去除系统进行免疫去除前后的猴血浆2DGE图谱 安捷伦高丰度蛋白去除柱 (MARC) * 商业化的多重亲和去除血浆高丰度蛋白的分离系统 ProteomeLab IgY蛋白质组分组分离系统 (Beckman Coulter 公司) ProteoExtract Albumin/IgG高丰度蛋白去除试剂盒 (MERCK公司) Aurum?Serum高丰度蛋白去除试剂盒(Bio-Rad公司) Agilent Multiple Affinity Removal Column (MARC) 安捷伦高丰度蛋白去除柱 (安捷伦公司) ProteoPrep? 20 Plasma Immunodepletion Kit (PROT-20) 去除血浆中20种高丰度蛋白 (Sigma-Aldrich公司) * L H 6种高丰度蛋白 同时清除 H H L L L L L L L L L L H H H H H H H L L L L 人体血清 样本 低丰度蛋白 低丰度蛋白 高丰度蛋白 血清/血浆高丰度蛋白清除柱 抗-白蛋白-树脂 抗-转铁蛋白-树脂 抗-结合珠蛋白-树脂 抗-?1-抗胰蛋白酶-树脂 抗-免疫球蛋白A-树脂 抗-免疫球蛋白G-树脂 A B 问题：清除柱是否仅去除特异的高丰度血浆蛋白？ 各抗体以特定比率混合装填成色谱柱 * 血浆蛋白组成复杂，蛋白质组学研究技术各有利弊， 单一技术平台不能达到最佳分离效果。 血清/血浆蛋白组学研究的多维策略 联合使用不同技术平台并加以适当改进是目前最通用的手段 主要包括： 去除高丰度蛋白 样本预分离系统 分离系统 质谱鉴定系统 * 血清/血浆蛋白组学研究的多维策略 获得了325个完整的蛋白质 高丰度蛋白去除+色谱分离+2-DE+联合质谱鉴定 两名健康男性血清 免疫亲和吸附法去除血清8种主要的高丰度蛋白 色谱预分离(pre-fractionation)， 离子交换色谱(anion-exchange chromatography，AEC) 分子筛色谱(size-exclusion chromatography，SEC) 2-DE分离富集的低丰度蛋白组分(f