不连续凝胶电泳示意图.ppt

第八章 电泳分离技术 第一节 电泳的基本理论及分类 一、原理 （一）概念及原理 1、电泳：是指带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动的现象。 2、原理 电泳技术就是利用在电场作用下，由于待分离样品中各种分子带点性质以及分子本身大小、性状等性质的差异，使带电分子产生不同的迁移速度，从而对样品进行分离、鉴定或提纯。 迁移率与带电分子所带净电荷成正比，与分子的大小和缓冲液的黏度成反比 （二）影响电泳的主要因素 1、大分子的性质 2、电场强度 3、溶液的pH 4、溶液的离子强度 5、 电渗 6、温度 7、支持物的影响 二、分类 （一）按分离原理分类 1、区带电泳 2、自由界面电泳 3、等速电泳 4、等电聚焦电泳 2、支持物电泳根据所用的支持物不同又可分为纸电泳、醋酸纤维薄膜电泳、琼脂凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）、SDS－聚丙烯酰胺凝胶电泳 第二节 常用电泳分离技术 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳  （一）基本原理 1、凝胶的聚合及孔径 2、电泳效应 （1）连续性电泳系统的凝胶浓度一致，凝胶中的pH值及离子强度与电泳槽液的相同。 （2）不连续电泳系统存在4个不连续性：凝胶层的不连续性；缓冲液离子成分的不连续性；pH值的不连续性；电位梯度的不连续性。4种不连续性，电泳时会产生3种物理效应，即样品的浓缩效应、凝胶的分子筛效应以及电荷效应。 （二）影响凝胶聚合的因素 1、试剂质量 2、凝胶浓度 3、温度和氧气的影响 （三）聚丙烯酰胺胶体的制备 （四）聚丙烯酸胺凝胶电泳的特点与用途 1、电渗作用比较小 2、凝胶孔径可调 3、电泳分辨率高 4、化学稳定性和热稳定性好 5、机械强度高 二、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳 （一）基本原理 在聚丙烯酰胺凝胶中加入阴离子去污剂十二烷基硫酸钠（SDS），不影响凝胶的形成，不影响蛋白质的电泳迁移率，因蛋白质的电泳迁移率主要取决于其自身分子量的大小。 SDS能打开蛋白质分子间的氢键和疏水键，使蛋白质变性成为松散的线状。 同时大多数蛋白质的每个氨基酸能与固定量的SDS相结合 ，形成SDS–蛋白质复合物 。 （二）SDS-聚丙烯酰胺凝胶胶体的制备 （三）SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳的优缺点 及应用 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳具有设备简单，样品用量甚微，操作方便等优点，现已成为测定大多数蛋白质分子量的常用方法 三、等电聚焦电泳 （一）基本原理 等电聚焦电泳是在电泳槽中放入载体两性电解质，当通以直流电时，利用两性电解质形成的一个由阳极到阴极逐步增加的pH梯度，使不同的酶或蛋白质聚焦于与其等电点相当的pH值位置而进行分离的电泳技术。 （二）pH梯度的建立 产生pH梯度的方法通常有两种：一种是用两种不同pH的缓冲液互相扩散，在混合区形成pH梯度，称为人工pH梯度。但这种pH梯度不很稳定，常用于制备电泳。另一种是利用两性电解质载体（Carrier ampholytes）在电场的作用下自然形成pH梯度，称为天然pH梯度。 （三）支持pH梯度的介质 （1）梯度溶液 （2）凝胶 （四）等电点聚焦电泳的操作过程 1、pH梯度支持介质的制备 2、电泳 3、分离组分的检测 （五）等电聚焦电泳的特点及应用 优点：（1）具有很高的分辨率（2）显现的区带窄（3）聚焦力强（4）可直接并准确测出等电点 等电聚焦技术的缺点是：①等电聚焦要求用无盐溶液，而在无盐溶液中蛋白质可能发生沉淀；②样品中的成分必须停留在其等电点处，不适用于在等电点不溶或发生变性的蛋白质 四、其他电泳技术 （一）琼脂糖凝胶电泳 琼脂糖凝胶可以用于蛋白质和核酸的电泳支持介质，尤其适合于核酸的提纯、分析琼脂糖凝胶电泳的分辨率较聚丙烯酰胺凝胶电泳差一些，但在分离范围上优于聚丙烯酰胺凝胶电泳，并有便于制备和操作的优点 （二）醋酸纤维素薄膜电泳 用醋酸纤维素条带或塑料薄膜做支持物来进行的电泳特点是分离快速，在低电压下，仅0.5～2h，分离出来的区带非常清晰鲜明，背景完全无色，操作方便，加上不会像纸电泳那样，造成蛋白质的变性，所以醋酸纤维素已在多种用途上完全取代滤纸电泳，而得到比滤纸电泳更理想的结果，醋酸纤维素溶解在丙酮里，被分离的区带就可以用比色计测定，非常准确 等电聚焦电泳槽 * 1、按有无固体支持物可以分为两类：自由电泳和支持物电泳。 （二）按有无固体支持物分类 制胶模 1 梳形样品槽模板 2 长玻璃板（后面） 3 短玻璃板（前面） 4 U形橡胶框 选择聚丙烯酰胺凝胶浓度参考值 15～20 5～10 2～3.6 104 104～105 1×105～2×106 核酸（RNA） 20～