CN106967788-CN201710192378-一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用.pdfVIP

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 CN 106967788 A (43)申请公布日 2017.07.21 (21)申请号 201710192378.X (22)申请日 2017.03.28 (71)申请人 南京中医药大学 地址 210023 江苏省南京市南京仙林大学 城仙林大道138号 (72)发明人 袁翰　黄桂成　 (74)专利代理机构 南京知识律师事务所 32207 代理人 陈旭 (51)Int.Cl. C12Q 1/66(2006.01) C12Q 1/42(2006.01) C12Q 1/02(2006.01) 权利要求书2页 说明书7页 附图5页 (54)发明名称 一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活 性检测方法在药物筛选中的应用 (57)摘要 一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活 性检测方法在药物筛选中的应用，本发明属于生 物医药领域，涉及一种检测细胞中碱性磷酸酶活 力的方法，包括以下步骤：A、对培养的细胞进行 基因工程修饰，导入非分泌型萤光素酶报告基 因；B、加入药物干预C、吸弃培养液并洗涤，加入 细胞裂解液裂解细胞，得到细胞裂解液；D、检测 E、计算等步骤。本发明提供的技术方案通过结合 萤光素酶报告基因手段达到量化细胞活力量化 的目的，从而指示药物干预中细胞碱性磷酸酶活 力和细胞活力两个维度的信息，并最终形成参数 A 化指标反映不同药物对单个细胞碱性磷酸酶活 8 力的影响。 8 7 7 6 9 6 0 1 N C CN 106967788 A 权　利　要　求　书 1/2 页 1.一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物筛选中的应用，其特征 在于，包括以下步骤： A、对培养的细胞进行基因工程修饰，导入非分泌型萤光素酶报告基因； B、加入药物干预 C、吸弃培养液并洗涤，加入细胞裂解液裂解细胞，得到细胞裂解液； D、检测：取部分细胞裂解液加入含有萤光素酶发光底物的溶液得到样品，检测样品得 到发光度值RLU；另取部分细胞裂解物或直接向发光检测后的样品中，加入碱性磷酸酶显色 底物溶液，以空白裂解液校正检测产物吸光度；以分解产物为标准品溶液计算的标准曲线， 标定样品分解产物产生量，为A；上述检测步骤均以空白裂解液位参比样品； E、根据得到的RLU与 A比值，计算最终萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性Q值，公式为Q =A/RLU。 2.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物 筛选中的应用,其特征在于，所述的非分泌萤光素酶报告基因为海肾萤光素酶报告基因、萤 火虫萤光素酶报告基因、细菌萤光素酶基因；所述的A步骤处理细胞为成骨细胞系、原代成 骨细胞。 3.根据权利要求2所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法，其特 征在于，所述的非分泌萤光素酶报告基因为海肾萤光素酶报告基因；所述的成骨细胞为成 骨细胞系MC3T3-E1或ROS  17/2.8细胞。 4.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物 筛选中的应用，其特征在于，所述的A步骤中，萤光素酶报告基因载体为细菌或病毒质粒，所 述的载体启动子为CMV、SV40。 5.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物 筛选中的应用，其特征在于，所述的A步骤后，可以设有转染后再培养扩增细胞并筛选纯化 的步骤。 6.根据权利要求1所述的一种基于萤光素校正的细胞碱性磷酸酶活性检测方法在药物 筛选中的应用，其特征在于，A步骤中