Western Blot 黄强开PPT.ppt

* 脱脂奶粉（5％） BSA(牛血清白蛋白)可能有封闭不均匀的情况 室温1小时 封闭膜上的空白位点 * 制胶 事前准备： 1、防护（很重要） 2、试剂？ 3、其他耗材？ 4、仪器正常？ * 制胶 * 丙烯酰胺和N,N’-亚甲双丙烯酰胺 水 SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED 过硫酸铵 APS 凝胶成份 负极 * 浓缩胶 分离胶 加样孔 正极 5% 80V 8%~15% 120V 清洗玻璃板，晾干 玻璃板对齐，卡紧，上架 配分离胶，灌胶（APS和TEMED最后加，避免气泡） 水封（折射线） 配浓缩胶，插梳子（避免气泡） 上样 电泳 * 安装玻璃板 对齐，加紧 配胶 ，按顺序加，上下层胶一起配，节 省时间和枪头，最后加APS和TEMED。 要混匀，但不要过度，防止氧化 注意温度，温度与凝胶速度成正比 1、APS 4℃ 保存，约1周，现配 2、TEMED 室温避光，易挥发氧化失效 3、APS与TEMED放多，胶易碎 灌胶，下层胶 5-6ml左右 边混匀边加 从边上缓慢加 枪头液体不要打完 防止进空气 有少许气泡不用担心 加水液封时要慢，否则胶会被冲变型 凝胶 一般为30min－1h （37度孵箱 15min） 要放水平 出现折光线即可 表示胶凝 配上层胶，先不加TEMED 倒出水，滤纸吸干，加TEMED，上上层胶 配好上层胶 ，胶加满 ，可溢出 插梳子 梳子两边加少量胶液 防止第一空变形 等待胶凝时，融化，离心样品 拆下玻璃板，用水冲洗－－安装电泳装置，小玻 璃板面向内，大玻璃板面向外。一块胶，那槽另一边要 垫一块塑料板，加电泳液，外液40cm高－－拔梳子， 左右手均匀用力，垂直向上－－加样经验：不要吸进气 泡，枪头插至加样孔中，慢－快－慢，重要的样品后 加，－－电泳：上层胶80V下层胶 120V， Prestain Marker 做指示。 拆下玻璃板，用水冲洗 安装电泳装置，小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。 一块胶，那槽另一边要垫一块塑料板 加滤纸可防 漏液 加电泳液，内液加满，外液40cm （500ml 1 ×电泳液） 拔梳子要 均匀用力 左右同起 缓慢向上拔出 加样经验：不要吸进气泡， 对光加样，枪头插至加样孔 中一半的位置 慢－快－慢，边加边退 重要的样品后加 先顶后下滑 样品一般在1.0mm厚的胶加样50-100ug/lane 在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免 边缘效应。 电泳：上层胶80V下层胶120V（仅供参考）， Prestain Marker 做指示。时间不宜太长， 如时间较长，可选择冰浴。 注意正负极 不要插反 清水冲洗胶板，小心取出胶 * PVDF膜 NC膜 尼龙膜 灵敏度和分辨率 高 高 高 背景 低 低 较高 蛋白结合能力 100-200ug/cm2（适用于SDS存在时与蛋白结合） 80-100ug/cm2 400ug/cm2 机械强度 强 干的膜易脆 软而结实 溶剂抗性 强 差 差 使用前是否需要浸润 100%甲醛润湿 缓冲液润湿 缓冲液润湿 适用染色方法 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁、考马斯亮兰 胶体金、丽春红、酰胺黑、印度墨汁 不能用阴离子染料 适用检测方法 显色法、化学发光、荧光、放射性、化学荧光、快速免疫检测 显色法、化学发光、荧光、放射性 显色、化学发光、放射性 适用范围 普通蛋白WB、糖蛋白检测、蛋白质测序、氨基酸分析、重复检测 普通蛋白WB、氨基酸分析、重复检测。0.1um膜适用于7kDa以下蛋白 低浓度小分子蛋白、酸性蛋白、糖蛋白、蛋白多糖、核酸检测常用 价格 高 较低 低 选择合适的膜 湿转 将凝胶和固相基质夹在滤纸中间， 浸泡在转移装置的缓冲液中 系统复杂 时间长 半干转 将凝胶和固相基质象三明治一样加在用缓冲 液湿润滤纸之间。 简便 时间短 SDS PAGE电泳过程中，开始转膜前准备工作 1. 配新的 transfer buffer 500ml 预冷 2. 备滤纸 尺子 剪刀 转膜海绵 平口镊 3. 用甲醇浸泡PVDF膜至透明15s，放入transfer buffer 中 浸泡 至少5min（PVDF表面厌水，甲醇让其亲水带正电， 更好结合蛋白） VS（转膜液中甲醇作用：10%-20%既可以固定胶的形态不 至于变形，也可以使蛋白结合到膜上更稳定。 ） 湿转 浓度越大的胶，越韧，6%的胶要小心操作， 不能有破损－－按胶大小裁剪膜，和滤纸－－安装 黑－－胶－－膜 胶背面向上 膜光面向下 记住正反面 黑 胶 不能有气泡 戴手套操作 保护好胶和膜的表面 膜 安装转膜装置 注意：正负极 冰浴冷却（10℃） 20－40K